新型冠状病毒核酸检测模拟室内质控品的研制

杨传坤，赵峰峰，吴国球,2，陈克平,2(.东南大学附属中大医院检验科，南京20009；2.东南大学医学院检验系，南京20009)

新型冠状病毒(2019-nCoV，简称新冠病毒)可引起新型冠状病毒肺炎，此种病毒传播性强、传播迅速，且人群普遍易感[1]。早发现、早确诊、早隔离是传染病防控的关键，新冠病毒核酸检测在疫情防控中扮演重要的角色[2]。国家卫生健康委员会发布的各版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，均将核酸检测阳性作为新冠病毒感染确诊金标准。截至目前，国家药品监督管理局已经批准了约20种采用实时荧光RT-PCR技术的新冠病毒核酸检测试剂。此技术灵敏度高、操作简便、成本较低，可在疾病早期或潜伏期内识别微量的病毒颗粒[3]。受到疾病发展阶段、样本采集质量、样本运输保存条件、试剂耗材质量与操作人员水平等影响，核酸检测结果会产生“假阴性”与“假阳性”[4-6]。鉴于此，各类新冠病毒核酸检测实验室操作规范与专家共识均建议进行室内质控，持续监测核酸检测质量[7-9]。本研究利用国家卫生健康委员会临床检验中心的噬菌体病毒样颗粒样本，制备了更接近临床样本基质的新冠病毒模拟室内质控品，并初步评价其稳定性。同时，本研究对目前市场在售的新冠病毒核酸检测室内质控品进行分析总结，方便实验室根据需要进行选择，做好新冠病毒传染防控的核酸检测工作。

1 材料与方法

1.1样本 新冠病毒核酸检测质控品原料[10]由国家卫生健康委员会临床检验中心制备，2020年4月申请获得。该原料为噬菌体病毒样颗粒(假病毒)，包装规格为0.5 mL/支，浓度为105～106copies/mL。低温运输，收到后放-80 ℃保存。

1.2仪器及试剂 BG-Flex-48全自动核酸提取仪(上海伯杰公司)，Anadas9850全自动核酸提取及荧光PCR分析系统(厦门安普利公司)；核酸提取及纯化试剂、2019-nCoV核酸检测试剂盒(上海伯杰公司)，PBS(上海生工公司)，RNase抑制剂(南京诺唯赞公司)。

1.3方法

1.3.1样本处理 根据国家卫生健康委员会临床检验中心推荐，用0.01 mol/L PBS对新冠病毒质控品原料进行梯度稀释，获得1∶25、1∶125、1∶625稀释的模拟质控品。每支210 μL分装至1.5 mL离心管中(NONPYROGENIC &RNase-free/DNase-free)。共获得1∶25稀释度模拟质控品20支，1∶125稀释度模拟质控品30支，1∶625稀释度模拟质控品20支。同时，用新冠病毒核酸检测阴性(Ct值>38)的口咽拭子临床样本混合液代替PBS稀释该质控品，使该质控品获得与临床样本类似的基质，同样获得3个浓度梯度的模拟室内质控品。配制完成后取每个浓度的10支质控品立即进行核酸检测。剩余的1∶125稀释度模拟质控品中，10支加入RNA酶抑制剂，另10支不加入RNA酶抑制剂，然后均置于-20 ℃保存60 d，使用前平衡至室温后立即进行检测。

1.3.2核酸提取 取出预分装提取试剂的96孔核酸提取板，在生物安全柜内加入200 μL制备完成的模拟室内质控品，置于BG-Flex-48全自动核酸提取仪，加入磁套，选择自动化提取程序启动提取。提取获得的核酸立即进行检测。

1.3.3核酸扩增 按2019-nCoV核酸检测试剂盒说明书配制25 μL反应体系，含核酸扩增反应液12 μL，酶混合液4 μL，ORF1ab/N反应液(主要为引物与探针)4 μL，核酸样本5 μL。实时荧光RT-PCR扩增程序为：50 ℃ 10 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s， 55 ℃ 40 s，40个循环。在Anadas9850全自动核酸提取及荧光PCR分析系统进行扩增，检测新冠病毒ORF1ab及N靶基因。

1.3.4结果分析 根据实际扩增曲线调节起止值，进行分析，按上海伯杰试剂说明书中结果判读标准判断检测结果，确定模拟质控品靶基因ORF1ab及N的检测循环阈值(Ct)值。

2 实验与结果

2.1不同稀释基质对模拟质控品靶基因检测影响 用0.01 mol/L PBS与阴性临床样本梯度稀释质控品原料，得到3个浓度的模拟质控品，实时荧光RT-PCR检测结果显示，3种浓度质控品的N基因检测Ct值大于ORF1ab基因(约小3个Ct值)。当质控品进行1∶25和1∶125稀释时，PBS与阴性临床样本梯度稀释质控品间ORF1ab和N靶基因检测Ct值差异无统计学意义(P>0.05)；而当质控品进行1∶625稀释时，PBS与阴性临床样本梯度稀释质控品间ORF1ab和N靶基因检测Ct值差异有统计学意义，且阴性临床样本稀释效果优于PBS稀释。见表1。

表1 PBS与阴性样本梯度稀释质控品的靶基因检测Ct值

2.2模拟室内质控品稳定性评价 选择1∶125稀释制备的质控品(接近新冠病毒核酸检测试剂检测下限103copies/mL)评价其稳定性。将最初配制的此浓度质控品分成2组，其中一组加入RNase抑制剂，另一组不加任何物质，两组均放入-20 ℃冰箱保存。60 d后取出模拟质控品室温融化后立即进行检测。以未冻存质控品检测结果作为基础数据。结果表明，冻存前后ORF1ab基因与N基因的检测Ct值差异不具有统计学意义(P>0.05)。未添加RNase抑制剂的模拟室内质控品未发生显著降解。见表2。

表2 模拟室内质控品的60 d稳定性评价

3 讨论

新冠病毒核酸检测试剂是在疫情暴发情况下研发的临床检测试剂，大部分厂家无法获得大量临床样本进行检测试剂的性能验证。因此，进行严格的质量控制是非常必要的。本实验室相继参加上海临检中心(2020年2月)、国家卫生健康委员会临床检验中心(2020年3月)和江苏省临检中心(2020年6月)组织的新冠病毒核酸检测室间质评活动。同时，在疫情早期市场无可售相应室内质控品的情况下，本实验室从国家卫生健康委员会临床检验中心申请到噬菌体病毒样颗粒质控品原料进行室内质控。临检中心推荐使用PBS配制室内质控品，但无法反映基质效应。因此，本研究利用阴性临床样本作为稀释液配制梯度浓度的室内质控品，并且对这种模拟质控品进行初步评价。

本研究发现，用PBS和阴性样本稀释质控品原料，1∶25和1∶125稀释时，ORF1ab和N靶基因检测Ct值差异无统计学意义，而1∶625稀释时，ORF1ab和N靶基因检测Ct值差异有统计学意义。质控品原料初始浓度为105～106copies/mL，1∶625稀释后浓度约为160～1 600 copies/mL，而上海伯杰公司新冠核酸检测试剂最低检测限为1 000 copies/mL。因此，此稀释倍数制备的模拟室内质控品浓度在试剂检测限附近，检测得到的Ct值是不稳定的。同时，阴性样本作为稀释基质制备的模拟质控品成分复杂，这些因素造成Ct值的标准差与CV值均大于PBS 作为稀释基质时的标准差与CV值。但阴性样本稀释优于PBS，Ct值小，检测灵敏度更高。因此，本研究使用试剂检测下限2～5倍的浓度，即1∶125稀释得到的模拟室内质控品评价其稳定性。综上所述，本研究使用阴性临床样本作为基质制备模拟质控品是可行的；与PBS相比，阴性样本稀释制备的质控品可更好反映基质效应程度，检测灵敏度甚至更好，但需要更深入的研究。

同时，3个浓度水平的模拟质控品N靶基因检测Ct值均大于ORF1ab，即2个靶基因的检出率存在差别。其他研究者用荧光RT-PCR检测新冠病毒也发现N基因的阳性率高于ORF1ab基因[5]。Chu等[11]将研发的新冠核酸检测试剂检测临床阳性样本，发现N基因的灵敏度比ORF1ab基因高10倍。这可能由于被感染细胞中的新冠病毒mRNA数倍于基因组RNA，且新冠病毒不断转录新mRNA，这些mRNA均带有N基因，而仅带有少量ORF1ab基因，因此N基因阳性率高于ORF1ab基因[12]。这种检出率差异也可能由于检测试剂对靶基因的检测灵敏度不同，以及N基因固有的保守性不如ORF1ab造成的核酸序列交叉，造成N基因检测假阳性[5，12]。本研究使用的质控品非临床样本，N基因和ORF1ab基因检测Ct值差异应该由检测试剂对靶基因的检测灵敏度不同而造成。因此，在进行新冠核酸检测时，应关注单靶基因阳性的临床样本，结果判断应结合试剂盒的靶基因检测灵敏度和患者临床症状，避免弱阳性样本的漏检。

制备的模拟质控品可以保存60 d未发生显著降解，并且未加RNase抑制剂的模拟质控品稳定性不受显著影响。本研究制备模拟质控品后即冻存，使用时室温融化后立即检测。否则，考虑到阴性样本成分的复杂性，液态长期保存应该会影响质控品稳定性。但本研究使用的-20 ℃冻存条件一般实验室均具备，因此具有可操作性。

目前，广州邦德盛、北京康彻思坦与郑州标源等生物公司研发、在售新冠病毒核酸检测的室内质控品，均以假病毒为原料制备。这些质控品价格昂贵，其室内质量的监控作用待市场反馈。本研究使用阴性样本稀释制备的模拟质控品更接近临床样本基质，可保持靶基因检测灵敏度，可长期稳定保存。新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点推荐试剂盒阳性质控品(阳性对照)使用假病毒作为原料[13]，与本研究使用原料相同。在市售新冠病毒核酸检测室内质控品选择有限且价格昂贵，阳性临床样本难以获得的情况下，根据本研究利用阴性样本稀释试剂盒阳性对照制备模拟室内质控品，方法简单，成本低廉，可大量获得，可有效监测新冠病毒核酸检测质量。