红茶菌和中草药红茶菌体外抑制霍乱弧菌的研究

蒋小强　邱红辉　符乃方等

摘要[目的] 研究红茶菌和中草药红茶菌在体外对霍乱弧菌的抑制作用。 [方法] 采用试管稀释法（MIC），研究红茶菌与中草药红茶菌对霍乱弧菌的体外抑制作用。 [结果] 红茶菌与中草药红茶菌对霍乱弧菌都具有一定的抑菌作用，尤其是中草药红茶菌原液对高浓度的霍乱弧菌具有显著的抑菌作用。[结论]与红茶菌相比，中草药红茶菌对霍乱弧菌具有显著的抑菌作用，在临床上可用于对霍乱弧菌感染的预防。

关键词红茶菌；中草药红茶菌；霍乱弧菌；抑制

中图分类号S188+.4文献标识码A文章编号0517-6611（2015）07-004-03

Study on Inhibition of Vibrio cholerae by Kombucha and Chinese Herbal Kombucha in vitro

JIANG Xiao-qiang1， QIU Hong-hui1， FU Nai-fang2， JIANG Sheng-jun2* et al

（1. Center for Animal Disease Control and Prevention， Dongfang Animal and Husbandry Bureau， Dongfang， Hainan 570100； 2. Tropical Crop Germplasm Resources Institute， China Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract[Objective] To study the inhibitory effects of Vibrio cholerae by kombuchab and Chinese herbal kombucha in vitro. [Method] Using the tube dilution method to study the inhibition effect of Vibrio cholerae by kombuchaand Chinese herbal kombucha in vitro. [Result] Both Kombucha and Chinese herbal kombucha have antibacterial effects for Vibrio cholerae， and Chinese herbal Kampuchea has strong antibacterial effect for Vibrio cholerae with high concentration. [Conclusion] Compared with kombucha， Chinese herbal Kombucha has antibacterial effect significantly on Vibrio cholerae， which would be used to prevent clinical infection of Vibrio cholerae.

Key wordsKombucha； Chinese herbal kombucha； Vibrio cholerae； Inhibition

红茶菌保健饮料是一种由醋酸杆菌、酵母菌和乳酸菌等发酵红茶糖水所形成的微生态茶饮料。国内外医学界多年的研究和医学实践表明，饮用红茶菌饮料能有效预防和治疗多种慢性疾病，如预防癌症、治疗消化不良、缓解关节炎、治疗高血压等[1]。此外，红茶菌自身不仅易于存活和繁殖，而且具有很强的杀菌、拮抗和抑菌作用[2]。红茶菌的主要抑菌成分为有机酸、茶叶提取液成分以及红茶菌产生的抑菌蛋白成分[3-9]。为了进一步增强红茶菌的抑菌活性，除添加茶叶外，还添加甘草、菊花、罗汉果、啤酒花等中草药，制备出新型中草药红茶菌制剂[10]。霍乱弧菌是一种能特异引起人体剧烈腹泻症状的病菌。霍乱弧菌的主要致病机理是它主要分泌霍乱肠毒素与小肠黏膜上皮受体结合且进入细胞膜，作用于腺昔酸环化酶，使得ATP转变为cAMP，小肠上皮细胞分泌功能亢进，导致严重腹泻和呕吐[11]。Toda等[12]研究表明，红茶提取物对霍乱弧菌V569B 和V8 6 在1 h内均可杀灭，特别是V569B几乎在接触后立刻被杀灭。红茶提取物还可以在体外和体内试验中破坏霍乱毒素的作用。在体内试验中，红茶抽提物在CT 处理后5～30 min内均能抑制毒素作用，而在30 min 以后则无此效果。Toda等[13]进一步研究表明，儿茶素类在生物模型中也具有以上作用。在发达国家，由于卫生水平的提高，霍乱弧菌导致的病例日渐减少；但是，在发展中国家，霍乱弧菌导致的病例居高不下。虽然利用霍乱疫苗可以有效地预防霍乱，但是由于有效期短以及经济原因而难以在这些发展中国家推广。因此，探索利用低成本、高效的中草药微生态制剂预防霍乱，是值得研究发展的方向。霍乱弧菌的最适培养pH为6.5～7.5，属于喜欢偏中性以及弱碱性的病原菌。因此，能够产生大量有机酸以及耐酸性强的益生菌都能有效地抑制或拮抗霍乱弧菌。红茶菌包含自然界产酸性最强的醋酸菌，因此红茶菌能有效地抑制霍乱弧菌[6-7，9] 。为了比较红茶菌和中草药红茶菌的抑菌特性，笔者以霍乱弧菌标准株试验菌种研究红茶菌和中草药红茶菌对霍乱弧菌的抑菌效果，为临床上预防霍乱弧菌的感染提供理论和技术支持。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种O139群霍乱弧菌国际标准株MO45（Vibrio cholerae O139 international reference strain MO45）。该菌种由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室鉴定、保存和提供。红茶菌制剂和中草药红茶菌制剂为本实验室制备[10]。过滤的红茶菌制剂和中草药红茶菌制剂用一次性微孔滤膜过滤器过滤。

1.1.2培养基。

庆大霉素琼脂，用于霍乱弧菌的选择性培养，购自北京陆桥技术有限公司。LB培养基和MH肉汤培养自己配置。

1.2方法

1.2.1细菌培养。

将菌种O139群霍乱弧菌国际标准株MO45接种到LB液体培养基上振荡培养，接着接种到庆大霉素琼脂选择培养基，挑单菌落接种到5 ml肉汤培养基中，振荡培养24 h后的菌液用于试验。

1.2.2调配致病菌悬液。

将肉汤培养基上培养的霍乱弧菌分别置于生理盐水管中，充分混匀，校正浓度至0.5麦氏浊度（约1×108 cfu/ml）和5.0麦氏浊度（1×109 cfu/ml）。

1.2.3

采取试管稀释法确定中草药红茶菌的抑菌浓度。

每排安排6只2 ml的离心管，除每排第1支离心管外，每只离心管内加已高压灭菌的MH肉汤1 ml，每排的第1、2管分别加入2 ml受试物，依次对倍稀释至第7管，此时试管里的红茶菌制剂或中草药红茶菌制剂浓度依次是1∶1、1∶2、1∶4和1∶8，第6管作为测试菌生长质控，然后每管加入3.6 μl 0.5麦氏浊度或5.0麦氏浊度的测试菌液，用振荡器混合均匀，在37 ℃培养箱中静止培养12 h后，取出一环接种庆大选择培养基。根据是否有病原菌生长，确定微生态制剂对测试菌的抑菌效果。

1.2.4共培养时间对红茶菌和中草药红茶菌体外抑制霍乱弧菌的影响研究。

每排安排5只2 ml离心管，每只离心管内加1 ml红茶菌原液、红茶菌稀释液、中草药红茶菌原液和稀释液，然后每管加入3.6 μl 5.0麦氏浊度的测试菌液，用振荡器混合均匀，在37 ℃培养箱中静止培养1、2、4、8、12 h后，每个小时取出一环接种庆大选择培养基。根据是否有病原菌生长，确定共培养时间对微生态制剂抑菌效果的影响。

1.2.5红茶菌原液和中草药红茶菌原液对接种大剂量、高浓度霍乱弧菌的体外抑制作用的研究。

为了探索通过口服红茶菌和中草药红茶菌预防霍乱弧菌感染的可能性，每排安排6只2 ml的离心管，每只离心管内加1 ml红茶菌原液、中草药红茶菌原液，然后每管加入5、10、20、50、100、200 μl 5.0麦氏浊度的测试菌液，用振荡器混合均匀，在37 ℃培养箱中静止培养12 h后，取出一环接种庆大选择培养基。根据是否有病原菌生长，确定微生态制剂的抑菌效果。

2结果与分析

2.1过滤灭菌的红茶菌和中草药红茶菌对接种低浓度霍乱弧菌的体外抑制作用

由表1可知，1 ml过滤灭菌的红茶菌和中草药红茶菌菌液中接种3.6 μl麦氏浊度0.50的霍乱弧菌，培养12 h后接种霍乱弧菌选择性培养基，过滤灭菌的红茶菌原液、1∶1、1∶2稀释的过滤灭菌的红茶菌原液都能有效抑制所添加的霍乱弧菌的生长；过滤灭菌的中草药红茶菌原液、1∶1、1∶2、1∶4过滤灭菌的中草药红茶菌原液也都能有效抑制所添加的霍乱弧菌的生长，其余处理包括对照都有霍乱弧菌生长。这表明过滤灭菌的红茶菌制剂以及1∶1、1∶2稀释液能够有效杀灭低浓度的霍乱弧菌，其余稀释液不能完全杀灭低浓度的霍乱弧菌；相对于红茶菌，过滤灭菌的中草药红茶菌的抑菌效果比相应的红茶菌制剂强1倍左右。

表1过滤灭菌红茶菌和中草药红茶菌对低浓度霍乱弧菌的体外抑制效果

类别稀释比01∶11∶21∶41∶8CK

红茶菌---+++++++++

中草药红茶菌----++++++

注：“-”表示霍乱弧菌显色培养基中无霍乱弧菌生长；“+++”表示霍乱弧菌显色培养基中有大量霍乱弧菌生长。

2.2红茶菌和中草药红茶菌对接种高浓度霍乱弧菌的体外抑制作用

由表2可知，1 ml红茶菌和中草药红茶菌菌液及其稀释液中接种3.6 μl麦氏浊度5.0的霍乱弧菌，培养12 h后接种霍乱弧菌选择性培养基，红茶菌原液、1∶1、1∶2稀释红茶菌原液都能有效抑制所添加的高浓度霍乱弧菌的生长；中草药红茶菌原液、1∶1、1∶2、1∶4的中草药红茶菌原液也都能有效抑制所添加的高浓度霍乱弧菌的生长，其余处理包括对照都有霍乱弧菌生长。这表明红茶菌原液以及1∶1、1∶2稀释液能够有效杀灭高浓度的霍乱弧菌，其余稀释液不能完全杀灭高浓度的霍乱弧菌；相对于红茶菌，中草药红茶菌的抑菌效果比相应的红茶菌制剂强1倍左右。

表2红茶菌和中草药红茶菌对高浓度霍乱弧菌的体外抑制效果

类别稀释比01∶11∶21∶41∶8CK

红茶菌---+++++++++

中草药红茶菌----++++++

注：“-”表示霍乱弧菌显色培养基中无霍乱弧菌生长；“+++”表示霍乱弧菌显色培养基中有大量霍乱弧菌生长。

2.3共培养时间对红茶菌和中草药红茶菌抑制霍乱弧菌效果的影响

由表3可知，共培养1 h后，即无霍乱弧菌生长，表明红茶菌制剂、中草药红茶菌制剂能快速杀灭或抑制霍乱弧菌的生长。这也证明霍乱弧菌是对酸非常敏感的病原细菌。

表3共培养时间对红茶菌和中草药红茶菌制剂抑制霍乱弧菌效果的影响

类别共培养时间∥h124812

红茶菌原液-----

1∶1稀释红茶菌液-----

1∶2稀释红茶菌液-----

中草药红茶菌原液-----

1∶1稀释中草药红茶菌液-----

1∶2稀释中草药红茶菌液-----

注：“-”表示霍乱弧菌显色培养基中无霍乱弧菌生长。

2.4红茶菌原液和中草药红茶菌原液对接种大剂量、高浓度霍乱弧菌的体外抑制作用

[8] BATTIKH H，CHAIEB K，BAKHROUF A，et al. Antibacterial and antifungal activities of black and green Kampuchea teas[J].Journal of Food Biochemistry，2012（10）：1745-4514.

[9] CETOJEVIC-SIMIN D D，BOGDANOVIC G M，CVETKOVIC D D，et al.Antiproliferative and antimicrobial activity of traditional kombucha and Satureja montana L. Kampuchea [J].J Buon，2008，13（3）：395-401.

[10] FU N F，WU J C，JIANG S J，et al.Clearance of free silica in rat lungs by spraying with Chinese Herbal kampuchea[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2013，2013：790792.

[11] 陈暄，屠幼英.茶叶和红茶菌中有效成分对肠道微生态平衡的作用[J].中国茶叶加工，2001（2）：31-33.

[12] TODA M，OKUBO S，IKIGAL H，et al.The protective activity of tea against infection by vibrio cholerae O1[J].Journal of Applied Bacteriology，1991，70：109-112.

[13] TODA M，OKUDO S，IKIGAI H，et al.The protective activity of tea catechins against experimental infection by vibrio Cholerae O1[J].Micobiol Immunlo，1992，36（9）：999-1001.

[14] 张兰.口服霍乱疫苗在感染性腹泻中的应用进展[J].医学信息，2011（8）：4016-4018.

[15] 申瑞瑞，李亚柯，王佰华.红茶菌发酵液抑菌活性的研究[J].湖南文理学院学报，2013，25（4）：29-32.

[16] 谢俊杰，钟青萍，佘世望，等.红茶菌液抑制作用的研究[J].食品科技，2000（6）：59-60.

[17] 符乃方，吴俊才，符启俊，等.中草药红茶菌的制备及其体外抗口蹄疫病毒活性[J].安徽农业科学，2014，42（17）：5500-5502.

[18] 符乃方，吴俊才，符启俊，等.中草药红茶菌的制备及其体内抗口蹄疫病毒活性[J].