霍乱弧菌检测方法的研究

李巧燕

摘 要：烈性肠道传染病霍乱能引起大范围乃至世界性大流行，在我国被列为甲类传染病。霍乱弧菌是导致感染者严重腹泻、引起霍乱的病原菌。霍乱弧菌的快速、准确检测是霍乱预防、控制的重要依据。目前，国内、外针对霍乱弧菌建立了许多有效的检测方法，尤其是分子生物学相关技术的应用，为霍乱弧菌的检测提供了新的手段。本文综述了近年来霍乱弧菌检测方法的研究进展。

关键词：霍乱弧菌；检测方法；分子生物学技术

一、传统检测方法

霍乱弧菌为需氧或兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，常以碱性蛋白胨水作为其选择性增菌培养基。霍乱弧菌生长迅速，可将标本在 37℃培 养 6～8h后取上层培养物做弧菌分离。霍乱弧菌在营养琼脂和碱性琼脂上呈无色、圆形、透明、光滑、湿润、扁平或稍凸起、边缘整齐的菌落。

为便于检出，根据其生长特性、对某些抗生素的敏感性及与其他常见肠道菌的差别，国内已研制出庆大霉素琼脂、四号琼脂，国外有TCBS等选择性培养基。这些培养基一般都含有胆盐、亚碲酸钾、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、庆大霉素、多黏菌素等抑菌剂。

在不同的选择性培养基上，霍乱弧菌具有不同的菌落特征。挑取可疑菌落后需进行一系列生化反应、血清凝集等试验，对结果进行综合判定，从而确定为霍乱弧菌[1]。目前，细菌培养、生化和血清学鉴定仍是霍乱弧菌实验室诊断的“金标准”，具有较好的敏感度和特异度。但不可否认，传统方法检测周期长、工作量大，且易受环境、培养条件及主观因素影响，不能满足疾病预防和控制快速反应体系的需求，不利于实验室的快速诊断。[2]

二、分子生物学方法

1.聚合酶链反应

（1）普通聚合酶链反应

运用常规聚合酶链反应（polymerasechain reaction，PCR）检测霍乱弧菌，一般选择霍乱肠毒素（choleraenterotoxin，CT）基因 ctx的保守序列作为靶基因[3，4]。一些非产毒株（如环境来源的菌株）有可能通过基因水平转移获得毒力基因成为产毒株，若仅检测 ctx基因容易造成漏检。因此，霍乱弧菌的其他重要基因，如毒力协同调节菌毛 A 基因（tcpA）、0抗原基因（rfb）、外膜蛋白基因（omp）以及毒力表达调控基因（toxR）等也被选用为 PCR的靶基因[5，6]，这大大提高了检测的特异度。PCR方法检测霍乱弧菌的特异度和敏感度都很高，但其本身也有缺点：一是因样本DNA交叉污染而出现假阳性；二是由于待测样本中的某些杂质蛋白及核酸提取过程中用到乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、SDS等，如未去除干净就会成为 Taq DNA 聚合酶的抑制剂，造成扩增失败。此外，标本中也可能含有会降解靶核酸的核酸酶，导致假阴性结果。因此，在运用 PCR检测霍乱弧菌时，要注意避免 DNA污染以及其他杂质的干扰。

（2）多重PCR

与常规PCR相比，多重PCR一次反应可检测多个基因，节省了时间和成本。国内外许多学者选用霍乱弧菌的毒素基因ctx、rfb、hly进行组合[7]，作为共同的靶基因，克服了由于毒力基因特异度不够高而造成的假阳性。多重 PCR 同时可准确区分不同血清型的霍乱弧菌和快速鉴定其是否为产毒株，可谓举多得，大大提高了检测效率。

Tarr等[8]运用多重 PCR技术同时检测霍乱弧菌和拟态弧菌的 sodB、副溶血弧菌的laEf、创伤弧菌的 hsp等 基因，G6mez.Duarte等[9]运用多重PCR从腹泻患者的临床标本中同时检测到包括霍乱弧菌在内的 7种肠道致病菌。这些都大大提高 了感染性腹泻病原学诊断的效率和水平，为多种致病菌的快速诊断提供了很好的思路和方法。多重PCR 的引物设计要注意避免各对引物之间的相互干扰和各目的片段之间的非特异性扩增。

（3）荧光定量 PCR 荧光定量

PCR 自动化程度高、特异性强、无交叉污染，在霍乱弧菌的快速诊断中得到广泛应用。尤其是近年来，随着引物与探针的设计更精确、多通道荧光 PCR仪的开发与广泛使用，多重荧光定量 PCR技术 日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等优点而广泛应用于病毒、细菌、真菌等多种病原体的快速检测，成为应用的热点。Huang等[10] 选取 Ol和 O139群特异的 rbf基因以及 ctxA、hylA等作为靶点，建立了四重荧光定量 PCR体系，不仅克服了单重荧光定量 PCR仅检测毒力基因特异度不高而造成假阳性的缺点，而且能很好检测并区分 01群和 O139群霍乱弧菌及其毒力株，最低检出限达每个反应 2个菌落形成单位（colonyformingunit，CFU）。这与单重荧光定量PCR的最低检出限相当，降低了检测成本，提高了检测效率。Fykse等[1l]运用基于分子信号标记的多重荧光定量 PCR体 系检测环境标本中霍乱弧菌的 ctxA、tcpA、toxR、hlyA、groEL等多个基因的不同组合，在一定程度上削弱了标本中杂质的干扰，提高了 PCR技术对环境标本检测的特异度，敏感度也较 TaqMan探针和 SYBR Green I方法提高了 100 倍。可见，多重荧光定量 PCR技术已成为未来检测技术发展的趋势，但必须保证不同探针所标记的光基团问无相互干扰，且各目的片段有相近的擴增效率。

2、基因芯片

与 PCR方法相 比，基因芯片技术能同时获得更多病原学、生物学方面的信息，从而更为全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]运用基因芯片技术对多种致病性弧菌的毒力、毒素、耐药基因及潜在的毒力基因进行全面分析，对掌握这些细菌的致病性及进行有效预防、控制等具有重要意义。但基因芯片成本较高，距离推广应用尚需时间等待。

3、环介导恒温扩增技术

环介导恒温扩增（1oop.mediated isothermal amplification，LAMP）技术是 2000年 Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。此方法针对靶基因的6个区域设计 4条特异性引物，利用链置换 DNA 聚合酶（BstDNA polymerase）在恒温条件（60-65℃）孵育 40-60min，引发自动链循环取代反应，完成对靶基因的扩增。扩增产物可通过电泳或直接通过副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行检测。Yamazaki等[13]。采用 LAMP检测霍乱弧菌的 ctxA基因，最低检测限达每个反应 1.4 CFU，比普通PCR高近 10倍，说明该方法具有很高的灵敏度。

参考文献

[1]闻玉梅.现代医学微生物学[M].上海：上海医科大学出版社，1999：331-334.

[2]王秀茹.预防医学微生物学及检验技术[M].北京：人民卫生出版社，2002：338-339.

[3]王家豪，杨长业，候金英 应用一步法快速检测乙型肝炎表面抗原 中国公共卫生杂志，1998，14（1）：47～48.

[4]曾章新，刘文星，朱忠勇，等.胶体金免疫层析法检测乙肝表面抗原的评价.中华 医学检验杂志，1999，22（6）：327.