成人与新生儿来源的间充质干细胞circRNAs 差异表达谱分析及功能预测

梁甲武，胡 巍，屈 爽，袁一方，郭 斌

解放军医学院/ 解放军总医院第一医学中心 口腔科，北京 100853

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化和自我更新能力，其促进组织动态平衡和损伤修复方面的作用越来越受到重视[1]。然而，近年来研究发现，随着年龄增长，MSCs 的再生能力下降，细胞功能出现障碍[2]。增龄对于MSCs 细胞命运的具体调控机制尚不清楚。通过探索增龄调控MSCs 细胞命运的具体机制，从而实现延缓甚至逆转MSCs 衰老，成为未来的发展方向。环状RNA(circular RNAs，circRNAs) 是一类反向剪接形成的闭合环状结构的非编码小RNA，与微小RNA(microRNAs，miRNAs) 内源性竞争性结合是circRNAs 的主要生物学功能之一。CircRNAs通过竞争性结合miRNAs，解除miRNAs 对靶基因的抑制作用，进而促进靶基因表达。目前研究发现，circRNAs 在组织器官发育和疾病发展等多个领域均发挥调控作用[3-4]。但circRNAs 在干细胞生物学领域的研究相对较少，对MSCs 的细胞命运影响仍待深入探索。本研究通过运用多种生物信息学方法，对成人与胎儿来源MSCs 的circRNAs差异表达谱进行分析， 并通过基因本体(Gene Ontology) 注释和 KEGG 通路 (KEGG pathway) 分析对circRNAs 可能发挥作用的信号通路进行预测，探究circRNAs 在增龄调控MSCs 细胞命运中的作用，为延缓甚至逆转MSCs 衰老提供新的理论依据。

材料与方法

1 circRNA 微阵列数据及数据分析 本研究中使用的circRNA 微阵列数据GSE122178 从Gene Expression Omnibus(GEO) 数 据 库 (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) 下载，获得了来源于成人与新生儿MSCs 的 circRNAs 表达谱。GSE122178 数据集包括3 例成人骨髓来源的MSCs 样本(GSM3457280、GSM3457281、GSM3457282)、3 例 围 生 期 新生儿脐带血来源的MSCs 样本(GSM3457283、GSM3457284、GSM3457285)。采用 GEO2R 在线分析工具对上述两组数据进行分析，并对差异表达circRNAs 进行筛选。

2 miRNAs 结合位点及下游靶基因预测 利用CircInteractome 在线工具预测circRNAs 的miRNAs结合位点， 并根据 Context+score percentile 评分对预测位点进行筛选。之后联合应用miRDB 和Targetscan 数据库对下游靶基因进行预测，并通过韦恩分析检测出共表达的靶基因。

3 GO 注释和KEGG 分析 GO 注释将基因功能分为生物过程(BP)、细胞成分(CC) 和分子功能(MF)三个部分。应用DAVID 在线工具对共表达的靶基因进行GO 注释和KEGG 分析。

4 统计学分析 计量数据以-x±s表示。以P＜0.05 作为 mRNAs 差异表达、GO 注释和 KEGG 分析的标准。以 |Fold change| ＞ 2 且P＜ 0.05 作为circRNAs 显著差异表达的标准。

结 果

1 成人与新生儿来源的MSCs 差异表达的circRNAs 基因芯片微阵列分析显示，围生期新生儿脐带血来源的MSCs 与成人骨髓来源的MSCs 相比，存在4 140 个不同程度差异表达的circRNAs，其中66 个circRNA 表达显著上调，107个circRNAs 表达显著下调( 图1)。在表达上调和下调变化中，最为显著的分别是hsa_circ_0080170和hsa_circ_0060055。

2 hsa_circ_0080170 和 hsa_circ_0060055 下 游miRNAs 及靶基因预测 利用CircInteractome 对差异表达最显著的hsa_circ_0080170 和hsa_circ_0060055 的miRNAs 竞争性结合位点进行预测。结果显示，hsa_circ_0080170 具有 6 个 miRNAs 结合位点，hsa_circ_0060055 具有 28 个 miRNAs 结合位点。通过进一步参考Context+score percentile评分，最终各筛选出2 个miRNAs 进行下一步功能分析预测( 表1)。联合运用miRDB 和Targetscan数据库分别预测hsa-miR370、hsa-miR203a、hsamiR1225-5p 和hsa-miR197 可能调控的下游靶基因，并将2 个数据库的预测结果进行韦恩分析。结果显示，hsa-miR370 有 551 个靶基因，hsamiR230a 有 163 个靶基因，hsa-miR1225-5p 有 180个靶基因，hsa-miR197 有411 个靶基因( 图2)。

表 1 hsa_circ_0080170 和 hsa_circ_0060055 的 miRNAs结合位点Tab. 1 miRNAs binding sites of hsa_circ_0080170 and hsa_circ_0060055

3 GO 注释 和 KEGG 分 析 利 用 DAVID 对 hsamiR370 的 551 个靶基因和 hsa-miR230a 的 163 个靶基因进行GO 功能注释，结果显示靶基因在94个GO 项中富集(P＜0.05)，多涉及基因的转录调控和干细胞的分化及干性维持。hsa-miR1225-5p的180 个靶基因和hsa-miR197 的411 个靶基因的GO 注释结果显示，靶基因在58 个GO 项中富集(P＜0.05)，多与基因表达调控和组织再生相关。两组GO 注释结果中的前10 个重要富集项以生物过程、细胞组分和分子功能为分类在图3 和图4中显示。基于GO 注释的结果，对hsa-miR370 和hsa-miR203a 的714 个预测靶基因进行KEGG 通路分析，结果显示所选靶基因与包括多能干细胞调控通路和Ras 信号通路在内的31 条信号通路相关(P＜0.05)( 图5)。此外，KEGG 通路分析发现与hsamiR1225-5p 和 hsa-miR197 的 591 个预测靶基因相关的17 条信号通路，包括肌动蛋白细胞骨架调控通路和泛素介导的蛋白水解等与干细胞命运调控相关的信号通路( 图6)。

图 1 3 例成人骨髓来源的间充质干细胞样本(GSM3457280、GSM3457281、GSM3457282) 和3 例围生期新生儿脐带血来源的间充质干细胞样本(GSM3457283、GSM3457284、GSM3457285)的circRNAs表达谱A：热图； B：火山图Fig. 1 circRNAs expression profiles of 3 adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells (GSM3457280, GSM3457281,GSM3457282) and 3 perinatal neonatal umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells (GSM3457283,GSM3457284, GSM3457285) were analyzed A: heat map; B: vocano plot

图 2 hsa-miR230a、hsa-miR370、hsa-miR197和hsa-miR1225-5p各自的miRDB和Targetscan数据库的下游靶基因预测结果及韦恩分析Fig. 2 Prediction results and Venn analysis of downstream target genes in the respective miRDB and Targetscan databases of hsa-miR230a,hsa-miR370, hsa-miR197 and hsa-miR1225-5p

讨 论

图 3 hsa-miR370和hsa-miR203a的预测靶基因的前10项重要富集项以生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)为分类展示Fig. 3 The top 10 enriched gene ontology (GO) terms of the predicted target genes of hsa-miR370 and hsa-miR203a under the three main GO categories (BP: biological process; CC: cellular component; MF: molecular function)

图 4 hsa-miR1225-5p和hsa-miR197的预测靶基因的前10项重要富集项以生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)为分类展示Fig. 4 The top 10 enriched gene ontology (GO) terms of the predicted target genes of hsa-miR1225-5p and hsa-miR197 under the three main GO categories (BP: biological process; CC: cellular component; MF: molecular function)

图 5 hsa-miR370和hsa-miR203a的预测靶基因的前10条重要KEGG通路Fig. 5 The top 10 significant KEGG pathways of the predicted target genes of hsamiR370 and hsa-miR203a

图 6 hsa-miR1225-5p和hsa-miR197的预测靶基因的前10条重要KEGG通路Fig. 6 The top 10 significant KEGG pathways of the predicted target genes of hsamiR1225-5p and hsa-miR197

circRNAs 不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾结构，以外显子环化或内含子环化的方式成环。最初circRNAs 发现于植物类病毒中，并被认为是低丰度和技术限制造成的剪接错误的副产品[5]。直到近几年，伴随着高通量测序技术和生物信息学的快速发展，circRNAs 的结构和功能才逐步被发现。目前研究发现，circRNAs 由于特殊的环形结构，具有高度保守性、不易被核酸外切酶降解等特点[6-7]。同时，随着对circRNAs 功能的深入研究，circRNAs 的海绵机制( 竞争性结合miRNAs)、与RNA 结合蛋白相互作用、参与蛋白质翻译、调控基因转录等功能已陆续被发现。此外，研究人员已发现circRNAs 在口腔癌[8]、心血管疾病[9]、骨关节炎[10]等疾病发生发展过程中发挥作用，而且还会参与调控骨形成能力[11]、神经系统发育和衰老[3]等生理过程。近期，关于circRNAs 对间充质细胞影响的研究也逐渐增多。Wang 等[12]发现，CDR1as 可通过海绵吸附miR-7，激活ERK 信号通路，促进LPS 诱导炎症条件下的牙周膜干细胞增殖。hsa_circ_0074834 可通过竞争性结合miRNA-942-5p 调控ZEB1 和VEGF 的表达，以及促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，进而促进骨缺损修复，有望成为骨不连的关键治疗靶点[13]。

近年来，已有多项研究表明，增龄至少会影响MSCs 的部分功能。Du 等[14]发现，源自18 ～ 20岁、30 ～ 35 岁、45 ～ 50 岁三个不同年龄段捐赠者的牙周膜干细胞之间，细胞集落形成率、细胞周期和凋亡情况以及碱性磷酸酶活性存在显著差异。随着年龄的增长，牙周膜干细胞的集落形成能力下降，G2/S 期细胞减少，细胞凋亡增加，成骨分化能力下降。此外，陈裕浩等[15]发现，与源于幼年雄性猕猴的骨髓间充质干细胞相比，源于老年雄性猕猴的骨髓间充质干细胞形态呈宽大、扁平形，细胞增殖缓慢，成骨、成软骨及成脂分化能力下降， 伴随着 IL-1β、IL-4、IL-6 和 TNF-α等细胞因子表达降低。然而，目前关于circRNAs在增龄对于MSCs 细胞命运的调控机制中发挥的作用少有研究。

本研究在GEO 数据库检索出建立于2019 年的关于circRNAs 在成人与新生儿来源MSCs 的circRNAs 差异表达数据集GSE122178，并对其中的3 例成人骨髓来源的MSCs 样本和3 例围生期新生儿脐带血来源的MSCs 样本进行GEO2R 在线分析，获得显著上调的hsa_circ_0080170 和显著下调的 hsa_circ_0060055。 同时， 对 hsa_circ_0080170和hsa_circ_0060055 的下游miRNAs 及靶基因进行预测，初步形成circRNA-miRNA-mRNA 关系网络。并且KEGG 分析发现，hsa-miR370 和hsa-miR203a作为hsa_circ_0080170 的下游miRNAs 结合位点，显著富集到31 条信号通路；hsa-miR1225-5p 和hsa-miR197 作为hsa_circ_0060055 的下游miRNAs结合位点，显著富集到17 条信号通路。其中多条信号通路与干细胞分化及干性维持相关。因此，根据生物信息学分析结果，预测hsa_circ_0080170和hsa_circ_0060055 可能在增龄调控MSCs 细胞命运中发挥作用，具体作用机制待进一步实验验证。本研究通过探究circRNAs 在增龄调控MSCs 细胞命运中的作用，为进一步探索延缓间充质细胞衰老的调控机制提供了新的理论依据。