不同温度对紫色不结球白菜生理生化指标的影响

朱红芳,李晓锋,吴 轩,臧晓韵,朱玉英

(上海市农业科学院设施园艺研究所,上海市设施园艺技术重点实验室,上海201106)

温度是植物生长发育过程中的重要环境条件,对植物生长发育和蔬果贮存具有极大的作用。 温度的高低不仅影响植物的生长,而且对植物体内的渗透物质、活性氧、抗氧化酶系统和抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统产生明显影响[1]。 低温胁迫常造成植物苗弱,植株生长缓慢且产量低、品质差[2];而持续的高温胁迫则会使植物失水萎蔫,叶片枯黄脱落。 研究发现,麻竹[3]、大白菜[4]、大豆[5]和黄瓜[6]的抗氧化酶系统在受到不同温度胁迫时会产生应激反应而活性增加。

不结球白菜(Brassica rapa.ssp.chinensis)属十字花科芸薹属白菜亚种,又名青菜、小白菜、油菜等,以嫩叶为产品,品质柔嫩、营养丰富,具有生长期短、适应性广的特点,在我国长江中下游及其以南地区受到人们的喜爱[7]。 不结球白菜是一种喜冷凉性蔬菜,适宜的生长温度为18—25 ℃,温度过低或过高均会对其产生一定的影响。 紫色不结球白菜因富含高抗氧化的花青素而倍受青睐[8],然而花青素极易受到温度、光照等环境因素的影响,在生产栽培过程中紫色不结球白菜叶片中花青素的积累受高温和低温的影响较大,冬季栽培中因低温而积累花青素,但生长缓慢,产量低下;在夏季高温栽培中则因高温花青素降解,造成紫色不结球白菜栽培品种外观色泽和品质不佳。 在前期的试验中,本课题组发现5 ℃低温处理12 d 后,紫色不结球白菜叶片紫色加深,呈深紫色,花青素含量显著增加,且蛋白质、糖类物质、抗坏血酸等营养品质提高,而在35 ℃高温处理12 d,花青素含量急剧降低,叶片呈绿色,品质降低[9]。

本试验以紫色不结球白菜新品种‘紫艺’为材料,研究不同温度处理下其幼苗中蛋白质、脯氨酸等渗透物质含量,以及活性氧和抗氧化酶活性的变化,探索温度调控其生理生化的机制,以期为紫色不结球白菜的种植栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为紫色不结球白菜新品种‘紫艺’,由上海市农业科学院设施园艺研究所青菜课题组选育。该品种直立性强,叶形椭圆,呈紫红色,表面平滑,有光泽,叶背面可见纵横交错的紫色叶脉,具有抗霜霉病和病毒病、耐寒性强、风味浓郁等特点。

1.2 试验方法

试验于2017 年5—8 月在上海市农业科学院设施园艺研究所温室内进行,种子播种于容积为15 cm×10 cm×10 cm 的塑料营养钵中。 待植株长到四叶一心时,选择生长势基本一致的试验用苗随机分成3组,放在人工气候培养箱内,以适宜温度25 ℃为对照,设定高温35 ℃和低温5 ℃处理,光照强度均为80 000 lx,湿度均为60%。 分别在处理0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d 时取样,不同处理选取5 株大小一致的植株,每株选择离心叶第三片功能叶片,去掉叶柄,将叶片剪碎混匀,分装样品,测定相关指标。

1.3 指标测定

按照李合生[10]的方法测定脯氨酸含量,采用硫代巴比妥酸法(TCA-TBA)测定丙二醛(MAD)含量,采用超氧根阴离子(O2·-)对羟胺氧化方法测定O2·-产生速率。

抗氧化活性的测定:酶液的提取按照王爱国等[11]的方法,提取液为0.05 mol∕L、pH 7.8 的PBS,含0.2 mmol∕L EDTA 和1% PVP(冰箱保存)。 将0.1 g 不结球白菜叶片置于预冷研钵中,分次加入预冷的提取液1.6 mL,冰浴下研磨成匀浆,放入离心管中,4 ℃低温下12 000 r∕min 离心20 min。 上清液即为所需粗酶液,低温保存。 采用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性[12];采用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性[10];采用过氧化氢比色法测定过氧化氢酶(CAT)活性[10],抗坏血酸氧化物酶(APX)活性按照Nakano 等[13]方法测定。

谷胱甘肽还原酶(GR)活性及还原性抗坏血酸(AsA)、还原性谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSG)含量的测定参照郭欣欣等[14]方法。

1.4 数据处理

采用Excel 2016 和SPSS 20.0 软件对试验数据进行处理,并用Origin 9.5 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同温度对紫色不结球白菜‘紫艺’脯氨酸含量的影响

脯氨酸以游离状态存在于细胞质中,可以保护细胞膜系统[15]。 由图1 可见,在25 ℃条件下,从0 d到12 d,‘紫艺’脯氨酸含量在51.38—54.91 μg∕mL FW 之间变动,平均值为53.06 μg∕mL FW。 当温度为35 ℃时,脯氨酸含量呈先增后减的趋势,在8 d 时达到最大值63.47 μg∕mL FW,而后降至60.1 μg∕mL FW。 当温度为5 ℃时,脯氨酸含量持续上升,在12 d 时达到最大值76.92 μg∕mL FW,与0 d时相比,脯氨酸含量提高了31.20%。

2.2 不同温度对紫色不结球白菜‘紫艺’活性氧的影响

活性氧包括过氧化氢(H2O2)、超氧根阴离子(O2·-)等几种形式,其中H2O2是相对稳定的一种活性氧,也是一种有效的信号分子,植物在生长发育过程中受到胁迫时,可以通过H2O2提高免疫,增强植物对非生物胁迫的抵抗能力[16]。 在适宜的25 ℃条件下,从0 d 到12 d,‘紫艺’H2O2含量平均为6.32 μg∕mL FW;在35 ℃条件下,从0 d 到12 d,H2O2含量呈缓慢增高趋势,在0—4 d 和8—12 d 增长较明显,4—8 d 增长不明显。 在5 ℃低温条件下,从0 d 到12 d,H2O2含量先增高后降低,在8 d 时达到最大值11.02 μg∕mL FW,随后缓慢下降(图2A)。

超氧阴离子作为生物体代谢过程中产生的一种自由基,具有很强的氧化性,可致组织损伤。 在25 ℃条件下,从0 d 到12 d,‘紫艺’O2·-产生速率平均值为0.94 μmol∕(g·min);在35 ℃高温下,从0 d 到12 d,O2·-产生速率呈先增高后降低趋势,在8 d 时达到最大值1.62 μmol∕(g·min),12 d 时O2·-产生速率为1.34 μmol∕(g·min);在低温5 ℃时,O2·-产生速率呈先增后减趋势,在10 d 时达到最大值,12 d 时为1.64 μmol∕(g·min)(图2B)。

2.3 不同温度对紫色不结球白菜‘紫艺’抗氧化酶活性的影响

过氧化物酶(POD)是一种高活性的氧化还原酶,与植物呼吸、光合作用、生长素的氧化和木质素的形成有关,其活性随植物生长发育和环境条件的变化而变化。 在适宜的25 ℃条件下,从0 d 到12 d,‘紫艺’POD 活性平均值为8.61 μmol∕(g·min) FW,变化不显著;在5 ℃时,POD 活性呈现缓慢增长的趋势,从0 d 到12 d,POD 活性由8.52 μmol∕(g·min) FW 增长至9.68 μmol∕(g·min) FW,增加了13.62%;在35 ℃时,从0 d 到12 d,POD 活性呈持续下降趋势,且在8—10 d 迅速下降,从7.66 μmol∕(g·min) FW 降至6.52 μmol∕(g·min) FW(图3A)。

超氧化物歧化酶(SOD)是一种抗氧化金属酶,具有特殊的生理活性,能够清除生物体内的有害自由基。 在25 ℃条件下,从0 d 到12 d,‘紫艺’SOD 活性平均值为113.36 μmol∕(g·min) FW;在35 ℃条件下,SOD 活性呈先增后降趋势,从0 d 到10 d 持续升高,在10 d 时到达最大值190.25 μmol∕(g·min) FW,之后下降;低温5 ℃时,SOD 活性随时间逐渐增强,从0 d 的111.25 μmol∕(g·min) FW 增加到12 d 的176.11 μmol∕(g·min) FW(图3B)。

过氧化氢酶(CAT)是一种末端氧化酶,其生物学功能是催化过氧化氢在细胞内分解为过氧化氢和氧气,并抑制过氧化氢形成有害的·OH。 在25 ℃条件下,从0 d 到12 d,‘紫艺’CAT 的活性平均值为59.98 μmol∕(g·min) FW;在35 ℃条件下,从0 d 到12 d,CAT 活性呈先增后减的趋势,在8 d 时到达最高的137.35 μmol∕(g·min) FW,12 d 时CAT 活性为116.96 mol∕(g·min) FW;在低温5 ℃时,CAT 活性随时间缓慢增强,从0 d 到12 d,CAT 活性由58.14 μmol∕(g·min) FW 增加至88.14 μmol∕(g·min) FW(图3C)。

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是清除植物体内活性氧和抗坏血酸代谢的关键抗氧化酶之一。APX 通过H2O2催化氧化,消化AsA。 在25 ℃条件下,从0 d 到12 d,‘紫艺’ APX 活性平均值为0.52 μmol∕(g·min) FW;在高温35 ℃时,从0 d 到12 d,APX 活性呈先增后减的趋势,在6 d 时达最高的0.84 μmol∕(g·min) FW,12 d 时APX 活性为0.66 μmol∕(g·min) FW;在低温5 ℃下,APX 活性随时间逐渐增强,从0 d 的0.53 μmol∕(g·min) FW 增加到12 d 的1.98 μmol∕(g·min) FW(图3D)。

2.4 不同温度对紫色不结球白菜‘紫艺’抗坏血酸-谷胱甘肽的影响

抗坏血酸又称维生素C,AsA 为还原型抗坏血酸,是衡量农作物产品品质的重要指标之一。 在25 ℃条件下,从0 d 到12 d,‘紫艺’AsA 含量平均值为480.77 μmol∕g FW,在445.45—517.64 μmol∕g FW 之间变动;在5 ℃低温下,AsA 含量先降低后增加,从0 d 的430.86 μmol∕g FW 先降低至415.88 μmol∕g FW后,再增加至12 d 的623.53 μmol∕g FW;在35 ℃高温下,AsA 含量从0 d 的438.77 μmol∕g FW 逐渐降低,12 d时AsA 含量降为403.14 μmol∕g FW(图4A)。

谷胱甘肽还原酶(GR)是一种将氧化型谷胱甘肽还原成还原型谷胱甘肽的黄素蛋白氧化还原酶。 在25 ℃条件下,从0 d 到12 d,‘紫艺’ GR 活性平均值为312.33 nmol∕(g·min) FW,在305.52—325.75 nmol∕(g·min) FW 之间变动;在5 ℃低温时,GR 活性随时间逐渐增加,从0 d 到12 d,GR 活性由330.64 nmol∕(g·min) FW 增加至530.64 nmol∕(g·min) FW;在35 ℃高温下,GR 活性呈先增后减的趋势,从301.44 nmol∕(g·min) FW 延长缓慢增加至10 d 时的379.24 nmol∕(g·min) FW,随后下降(图4B)。

还原型谷胱甘肽(GSH)具有抗氧化和抗御各种外源胁迫,以及清除过量活性氧和维持细胞内氧化还原平衡的功能。 在25 ℃条件下,从0 d 到12 d,‘紫艺’GSH 含量平均值为1.57 μmol∕g FW,在1.50—1.63 μmol∕g FW 之 间 变 动; 在5 ℃条 件 下, GSH 含 量 逐 渐 降 低, 从1.63 μmol∕g FW 降 低 至0.78 μmol∕g FW;在35 ℃条件下,GSH 含量从1.65 μmol∕g FW 逐渐降低为1.04 μmol∕g FW(图4C)。

氧化谷胱甘肽(GSSG)在还原型谷胱甘肽和谷胱甘肽还原酶共存的情况下对自由基清除具有协同催化作用,GSH∕GSSG 值对自由基清除率有明显的影响。 在25 ℃条件下,从0 d 至12 d,‘紫艺’GSSG 含量在23.88—20.65 μmol∕g FW 之间变动,平均值为22.32 μmol∕g FW;在5 ℃条件下GSSG 含量先增加后降低,由20.58 μmol∕g FW 增加至8 d 的28.54 μmol∕g FW,12 d 时降低为26.77 μmol∕g FW;在35 ℃条件下,GSSG 含量从24.23 μmol∕g FW 逐渐增加至64.16 μmol∕g FW(图4D)。

3 讨论与结论

温度的变化在一定程度上刺激了植物细胞膜,导致细胞膜中不饱和酸、活性氧和脯氨酸含量增加。本试验中紫色不结球白菜叶片中脯氨酸含量在低温条件下呈上升趋势,在高温下呈先增后减趋势,H2O2在低温和高温胁迫下均呈现上升趋势,O2·-在低温和高温下均呈现先增后减的趋势,这与宁露云等[17]和寇刚[18]研究一致。

低温胁迫刺激组织、细胞的抗氧化系统,抗氧化酶活性增强或降低,从而提高组织、细胞抵御低温胁迫的能力[19]。 在高温胁迫下,随着SOD 活性的下降,白菜中POD 活性却逐渐增加,而过氧CAT 活性则出现先下降后上升的变化[20]。 本试验中紫色不结球白菜叶片中POD 活性在低温下呈下降趋势,高温下则呈上升趋势;SOD 和CAT 活性在低温和高温下变化趋势一致,在低温下均逐渐升高,在高温下则先升后降;APX 活性在低温下逐渐增加,在高温下呈先增后减趋势,这与黄瓜[21]和番茄[22]研究结果一致。 由于APX 是植物AsA 的主要消耗者,因此AsA 含量变化依据APX 活性的强弱变化,两者呈一定的负相关性。谷胱甘肽还原酶以还原型辅酶Ⅱ为唯一的还原力和电子供体催化还原型谷胱甘肽从氧化型谷胱甘肽中还原。 在温度的影响下,GR 活性增加,GSSG 含量增加,而GSH 含量下降。 本试验中AsA 含量在低温下先增后降,在高温下呈下降趋势;GR 含量在低温下呈上升趋势,在高温下呈先增后降趋势;GSH 含量在低温和高温下持续下降;GSSG 含量在低温下呈先增后减趋势,在高温下持续增加,这与张腾国等[23]的研究一致。

综上所述,通过在不同温度条件下对紫色不结球白菜生理生化指标的测定和分析,发现高温和低温均会诱导不结球白菜植物体内活性氧增加,使抗氧化酶系统和谷胱甘肽循环系统产生应激反应,从而提高植物抵抗温度变化的胁迫能力。 本研究明确了紫色不结球白菜受温度影响下生理生化机制的调节,可为紫色不结球白菜的栽培种植提供一定参考。