利用流式细胞术快速鉴定61 份百合品种倍性

陈敏敏,张永春*,蔡友铭,杨柳燕,聂功平

(1 上海市农业科学院林木果树研究所,上海市设施园艺技术重点实验室,上海201403;2长江大学园艺园林学院,荆州434025)

百合(Liliumspp.)为百合科百合属重要的球根花卉,广泛分布于北半球寒带与温带地区。 目前世界范围内已知的野生百合超过100 种,已注册的商业品种则超过上万种[1],百合园艺新品种更新速度快,开展新优品种自主选育对我国百合产业的发展至关重要,然而,商业品种一般杂合度高、遗传背景复杂,不同种系内与种系间开展杂交育种工作较为盲目,因此,开展遗传倍性鉴定对杂交育种工作尤为重要。

根据英国皇家园艺学会与北美百合学会制定的分类系统,百合主要分为亚洲百合杂种系(Asiatic hybrids,A)、东方百合杂种系(Oriental hybrids,O)、麝香百合杂种系(Longiflorum,L)、喇叭形和奥瑞莲杂种系(Trumpet and Aurelian Hybrids,T)、欧洲百合杂种系(Martagon Hybrids)、美洲百合杂种系(American Hybrids)、纯白百合杂种系(Candidum Hybrids)、其他种间杂交产生的杂种系(包括LA、LO、OT、OA、OL)等。 种内杂交一般产生AA、LL、OO、TT 等二倍体品种群,但也容易产生三倍体品种群,如铁炮系(LLL)、亚洲系(AAA)、东方系(OOO)等[2]。 种间杂交容易产生三倍体,如三倍体LAA 或ALA 杂交后代是铁炮系(L)、亚洲系(A)杂交后代(LA)与亚洲系(A)回交的结果;东方系(O)与喇叭系(T)的杂交后代(OT)作为父本或母本与东方系(O)回交产生OOT 或OTO[3]。

百合倍性相关研究表明,除卷丹为三倍体外,大部分野生百合为二倍体[4];组间杂种多为三倍体、四倍体和一些非整倍体[5]。 李克虎等[4]采用染色体常规制片技术对45 个百合品种进行倍性分析,发现组内杂交品种大部分为二倍体,组间杂交品种大部分为三倍体。 周桂雪等[6]报道组内品种群如东方百合和麝香百合一般为二倍体,而组间品种多为三倍体。 Marasek-Ciolakowska 等[5]也报道三倍体LAA(ALA)和OOT(OTO)杂交种在百合品种中占很大比例。

流式细胞术(FCM)是20 世纪80 年代兴起的一项新技术,能简单、快速的检测植物的倍性,已被用于多种植物育种及倍性的鉴定中[7-10]。 本研究拟针对部分百合园艺新品种倍性不详的情况,采用本实验室前期建立的流式细胞仪倍性鉴定方法开展倍性快速鉴定[11],旨在为品种资源的高效利用与育种效率的提高奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

61 个代表性百合主栽品种均引自荷兰,包括19 个亚洲百合品种、16 个东方百合品种、15 个LA 杂交品种、9 个OT 杂交品种和2 个Martagon 系杂交品种。 二倍体对照材料为索邦(‘Sorbonne’,2n=2x=24),三倍体对照材料为木门(‘Conca d’or’,2n=3x=36)。

1.2 流式细胞仪倍性鉴定

取新鲜待测植物叶片0.1—0.15 g,放置于直径为6 cm 的培养皿中,加入1.0—1.5 mL Kiwifruit Buffer裂解液,同时用锋利刀片一次性快速切碎叶片至糊状(确保整个过程中材料浸没在解离液里,以便更好地游离细胞核),提取时间60 s;将培养皿中的液体用30 μm 滤网过滤到1.5 mL 离心管中,滤液保持在1.0 mL左右,置于4 ℃冰箱5 min。 取出样品,4 ℃下1 000 r∕min 离心5 min,弃上清,加入600 μL 解离液与60 μL 预冷PI 染色液于4 ℃避光染色15 min,处理结束后上机测试,所用仪器为BeckmanColour 流式细胞仪。 采用Excel 2010 软件进行数据处理。

2 结果与分析

被检测的61 个百合品种可以分为5 类,包括亚洲百合(A)、东方百合(O)、LA、OT、Martagon 系,对不同种系的倍性情况进行统计分析,结果表明:19 个亚洲百合品种中,16 个(‘Heartstrings’‘White Twinkle’‘Trendy Savannah’‘Fata Morgana’‘Matrix’‘Trendy Havana’‘Golden Matrix’‘Tribal Dance 600’‘Trendy Dakota’‘Tiny Padhye’‘Tiny Bee’‘Tiny Rocket’‘Tiny Invader’‘Tiny Double You’‘Tiny Pearl’‘Levi’)为二倍体(2n =2x =24),1 个品种(‘Lancifolium Flore Pleno’)为三倍体(2n =3x =36),2 个品种(‘Pink Flight’‘Pearl Frances’)为四倍体(2n=4x =48)(图1),种内杂交的亚洲百合大部分为二倍体,占所有测定品种的23.26%。

16 个东方百合品种中,15 个品种(‘Roselily Elena’‘After Eight’‘Sheer Blonde’‘Sunny Martinique’‘Sunny Keys’‘Marlon’‘Roselily Monica’‘Roselily Natalia’‘Reeleeze’‘Roselily Samantha’‘Souvenir’‘Roselily Thalita’‘Sunny Azores’‘Roselily Isabella’‘Entertainer’)为二倍体(2n =2x =24)。 1 个品种(‘Viviana’)出现二倍体非整倍体现象(图2),种内杂交的东方百合大部分为二倍体,占所有测定品种的24.59%。

15 个LA 品种中,11 个品种(‘Albufeira’ ‘Armandale’ ‘Beau Soleil’ ‘Golden Stone’、‘Merlet’‘Flamington’‘Nashville’‘Bonsoir’‘Royal Sunset’‘Eyeliner’‘Indian Summerset’)为三倍体(2n=3x =36),1 个品种(‘Honesty’)为四倍体(2n=4x=48)。 3 个品种(‘Bach’‘Fangio’‘Mynnou’)出现三倍体非整倍化现象。 种间杂交的LA 品种大部分为三倍体,15 个LA 品种中11 个为三倍体,占测定品种的18.03%(图3)。

9 个OT 品种中,1 个品种(‘Black Beauty’)为二倍体(2n=2x=24),5 个品种(‘Touchstone’‘Palazzo’‘Manissa’‘Profundo’‘Competition’)为三倍体(2n=3x=36),2 个品种(‘Passion Moon’‘White Eyes’)为四倍体(2n=4x=48)。 1 个品种(‘Zambesi’)出现三倍体非整倍化现象。 种间杂交的OT 品种大部分为三倍体,9 个OT 品种中5 个为三倍体,占测定品种的8.20%(图3)。

2 个Martagon 品种中,1 个品种(‘Manitoba Morning’)为二倍体(2n =2x =24),1 个品种(‘Sunny Morning’)为三倍体(2n=3x=36)。

3 讨论

我国野生百合资源丰富,几大系中,亚洲百合(Asiatic hybrids)是由Sinomartagon 系(包括Lilium dauricum、Lilium lancifolium等)种内杂交形成[12]。 东方百合(Oriental hybrids)则是Archelirion 系种内杂交形成,铁炮百合(Longiflorum hybrids)是Leucolirion 系种内杂交形成[13]。 本研究中不同种系品种鉴定结果表明,19 个亚洲百合中有16 个为二倍体,16 个东方百合有15 个为整二倍体,与李克虎等[4]、周桂雪等[6]、简佳等[14]报道的大部分百合组内杂交品种为二倍体一致;19 个亚洲百合中有1 个三倍体,有2 个四倍体,这一结果与李克虎等[4]报道的切花亚洲百合多为二倍体,但也有部分三倍体和四倍体品种,与Zhou 等[2]报道的亚洲百合种内杂交也易产生三倍体结果一致。 15 个LA 百合有11 个为三倍体,9 个OT百合有5 个三倍体(图3),与李克虎等[4]报道的组间杂交品种多为三倍体结果一致。

荣立苹等[15]采用根尖压片法对卷丹、毛百合、朝鲜百合、兰州百合、大花卷丹、有斑百合、细叶百合、垂花百合的染色体数目进行了观察研究,结果表明2%—10%二倍体种中出现了染色体数目的非整倍性变异,在部分百合中还观察到B 染色体。 Khan 等[16]报道当二倍体LA 杂交种与亲本亚洲百合后代回交时,会产生二倍体、三倍体和非整倍体(2x-1,2x+2,2x +3)杂交后代;Luo 等[17]报道三倍体OT 杂种(OOT)的BC2后代是非整倍体,其染色体数目从25 到29 不等;Xi 等[18]报道异源三倍体LO 杂交种(LLO)易产生非整倍体功能性雌性配子,从而造成所有的后代均为非整倍体。 因此,商品种会出现一定比例的非整倍体,本研究中也鉴定出1 个二倍体非整倍体品种和4 个三倍体非整倍体品种,包括了东方百合、LA 和OT 百合,说明不同种系均可能出现非整倍体。

不同倍性的百合材料杂交亲和性不同,Johnston[19]提出Endosperm Balance Number(EBN)假说,认为在杂种胚乳中,只有当母本基因与父本基因比为2∶1时胚乳才可以正常发育,否则胚乳的发育会停滞。 向仕华等[20]报道以四倍体为母本的杂交组合种子萌发率远高于以二倍体为母本的杂交组合;Barba-Gonzalez 等[21]报道以二倍体为母本与三倍体百合进行杂交能获得子代,而以四倍体为母本、三倍体为父本时没有获得子代。 上述研究表明,不同倍性百合做亲本时会显著影响杂交子代,因此在亲本选配前了解倍性有利于提高杂交效率。 另外,多倍体百合相较二倍体不仅观赏性更佳、抗性更强,而且作为杂交亲本有可能可以克服远缘杂交的不育性[22]。

从Da Laat 等[23]首次采用流式细胞术检测植物倍性水平以来,该方法已成为植物倍性鉴定的常用方法。 较传统的形态学鉴定与染色体计数鉴定法,流式细胞仪鉴定法具有如下优点:样品制备程序简单;检测通量高,可在较短时间内快速检测大量样品;精准度高,每个样品可收集大量细胞核进行检测;同时,这种方法仅需少量植物材料,对植物破坏性小。 本研究采用本实验室已建立的鉴定方法对61 个百合品种叶片材料进行快速倍性鉴定,获得的结果可为花期不同种系间杂交组合的配制提供理论参考。 本研究发现以二倍体品种(‘Sorbonne’)或三倍体品种(‘Conca d’or’)为对照进行倍性检测时,有5 个品种存在非整倍体现象(图2、图3),但流式细胞仪仅能检测出其为非整倍体,无法确定其增加或缺失的染色体条数,仍需用染色体压片或荧光原位杂交技术对这些品种进行进一步确定。