甜瓜细菌性果斑病带菌种子的处理方法研究

李菊芬,林 涛,马国斌

(上海市农业科学院设施园艺研究所,上海市设施园艺技术重点实验室,上海201106)

细菌性果斑病(Bacteiral fruit blotch,简称BFB)是一种严重危害葫芦科植物的世界性病害[1-3],是影响瓜类生产的主要病害之一,其病原为嗜酸菌属西瓜种(Acidovoras citrulli)[4-5]。 由于细菌性果斑病菌是典型的种传细菌性病害[6-7],如不及时进行检测和灭菌处理,种子生产经营者和瓜农将面临遭受经济损失的风险。 建立快速、准确的检测方法和行之有效的灭菌处理方法是防控此病的重要手段。 目前,PCR 技术[8-13]、血清学检测技术[14]已广泛应用于细菌性果斑病菌的检测,但在种子处理方面尚缺乏有效的防治药剂[15]。 本试验以在新疆繁育的携带瓜类细菌性果斑病菌的甜瓜种子为材料,分别进行70 ℃、75 ℃、80 ℃干热灭菌、包衣和70 ℃干热灭菌+包衣5 种不同的灭菌处理,采用本实验室前期建立的PCR 体系和实时定量PCR 方法分别对处理后的甜瓜种子带菌情况进行检测,并在此基础上进行活菌分离鉴定,旨在探索一种既不影响种子发芽率,又能有效杀灭种带细菌性果斑病菌的最佳处理方式,为甜瓜种子的生产和流通提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试甜瓜(Cucumis meloL.)种子:在新疆繁育的携带瓜类细菌性果斑病菌的‘东方蜜1 号’甜瓜种子。 供试菌株:由中国农业科学院郑州果树所提供的细菌性果斑病标准菌株(Acidovoras avenaesubsp.citrulli)。

1.2 方法

1.2.1 带菌种子的不同处理方法

将带菌的供试甜瓜种子随机分成6 组,每组2 kg,以其中1 组种子为对照(CK),其他5 组分别进行如下5 种不同处理。 处理1:40 ℃处理2 d,50 ℃处理1 d,70 ℃处理3 d,50 ℃处理1 d,40 ℃处理1 d。 处理2:40 ℃处理2 d,50 ℃处理1 d,75 ℃处理3 d,50 ℃处理1 d,40 ℃处理1 d。 处理3:40 ℃处理2 d,50 ℃处理1 d,80 ℃处理3 d,50 ℃处理1 d,40 ℃处理1 d。 处理4:包衣处理(包衣剂为卫福,有效成分为萎锈灵200 g∕L、福美双200 g∕L)。 处理5:处理1 +处理4。

1.2.2 PCR 检测

5 种处理和对照各取300 粒种子放入灭菌三角瓶中,加入30 mL 无菌双蒸水,置于28 ℃下200 r∕min振荡培养3 h,取1 μL 悬浮液作为PCR 模板。 选用特异引物BX-L1∕BX-S-R2(BX-L1:5’-CAGCTGGGAGCGATCTTCAT-3’;BX-S-R2:5’-GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA-3’)[9]进行PCR 扩增,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。 每种处理3 个重复。 普通PCR 所需试剂均购于天根生化技术有限公司。PCR 反应体系(25 μL):10 ×buffer 2.5 μL,MgCl22 mmol∕L,dNTPs 0.2 mmol∕L,Taq DNA 聚合酶1 U,正反向引物各0.2 μmol∕L,模板为1 μL 浸提液,无菌三蒸水补齐。 扩增条件:95 ℃3 min;94 ℃35 s,60 ℃35 s,72 ℃45 s,35 个循环; 72 ℃7 min。 PCR 仪为BIO-Rad T100TMThermal Cycler。 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,Goldview 染液染色后,于紫外凝胶成像系统(Tanon 3500)下观察并拍照。

1.2.3 实时定量PCR 检测

荧光染料为Takara 公司的SYBR green 定量PCR 染料,仪器为Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCR System,反应体系按照Takara SYBR©Premix Ex TaqTM说明书进行,扩增程序采用Bio-Rad CFX 荧光定量PCR 仪默认程序,即:95 ℃30 s;95 ℃5 s,60 ℃30 s,40 个循环,每个循环结束时收集荧光信号。 每个反应设置3 个重复,以对照作为参比,采用相对定量(ΔCT 法)的方法计算出各处理与CK 的CT 值之差(ΔCT),以2-ΔCT计算所得的值即为各处理的相对带菌量。

1.2.4 活菌分离检测

取CK 和各处理种子的悬浮液100 μL,于KB 固体培养基上均匀涂板,置于28 ℃恒温培养箱中倒置培养48 h,观察菌落生长情况。 每处理设3 皿重复。

1.2.4.1 选择性KB 平板的制备及涂板

选择性KB 培养基:蛋白胨20 g∕L,丙三醇10 mL∕L,MgSO4·7H2O 1.5 g∕L,K2HPO41.5 g∕L,琼脂15 g∕L,pH 调至7.0,121 ℃灭菌20 min,冷却至50 ℃时加入氨苄青霉素20 mg∕L、新生霉素5 mg∕L、放线菌酮25 mg∕L。 取CK 和5 种处理种子的悬浮液100 μL,于选择性KB 培养基上均匀涂板,置于28 ℃温箱中恒温倒置培养48 h,观察菌落生长情况。

1.2.4.2 总菌落DNA 提取及PCR 检测用无菌水冲洗选择性KB 培养基表面上分离培养的所有细菌菌落,离心浓缩,提取细菌的基因组DNA[16],并以此为模板,进行PCR 扩增验证。 反应体系及扩增程序同1.2.2。

1.2.4.3 不同浓度细菌性果斑病菌悬浮液的制备及涂板

挑取细菌性果斑病标准菌株于液体KB 培养基中,28 ℃振荡培养过夜,离心收集菌体,1 mL 无菌水吹打至悬浮状态,根据OD600值分别配成2 ×104cfu∕mL、2 ×103cfu∕mL、2 ×102cfu∕mL 3 个浓度梯度,分别在选择性KB 培养基和KB 培养基上进行涂板,每个浓度重复3 皿。 观察选择性KB 培养基对细菌性果斑病菌生长的影响。

1.2.5 不同处理对种子发芽的影响

取CK 和不同处理种子各100 粒,浸泡12 h,置于28 ℃恒温培养箱中催芽24 h,统计发芽率、根长,以此判定各处理对种子发芽的影响,3 次重复。

2 结果与分析

2.1 PCR 与实时定量PCR 检测

PCR 检测结果显示(图1):CK 和处理1—4 均可扩增出特异性目的条带(279 bp),但条带亮度有所差异,其中CK 最亮,处理4(包衣处理)的条带亮度最淡。 处理5(70 ℃高温处理+包衣处理)未扩增出目的条带。

实时定量PCR 检测结果显示(图2):与CK 相比,处理1—4 的种子相对带菌量均有不同程度的降低,且呈递减趋势,处理4 的种子相对带菌量降幅最为明显;处理5 基本检测不到带菌。

上述结果表明:带菌甜瓜种子经5 种处理后,种子带菌量均有所下降,其中以70 ℃高温+包衣处理的杀菌效果最佳。

2.2 活菌分离检测

2.2.1 KB 和选择性KB 培养基的涂板及总菌落DNA 的PCR 检测

不同处理的种子悬浮液在KB 培养基上涂板,经28 ℃恒温培养48 h 后,各处理和CK 均有菌落长出,其中以CK 长出的菌落最为密集,处理1 次之;处理2—5 的菌落总数虽相对较少,但杂菌生长旺盛(图3A)。 由于杂菌量过多,且生长速度较细菌性果斑病菌快,严重影响了总菌落DNA 的PCR 检测结果,因此,选用优化的选择性KB 培养基进行后续试验。

选择性KB 培养基的涂板结果表明(图3B):只有CK 和处理1 有菌落长出,处理2—5 均无菌落长出。 提取CK 和处理1 的总菌落DNA 进行PCR 检测表明(图4):二者均能扩增出目的条带(279 bp)。

2.2.2 选择性KB 培养基对果斑病菌生长的影响

将细菌性果斑病菌标准菌株悬浮液稀释成2 ×104cfu∕mL 至2 ×102cfu∕mL 3 个10 倍浓度梯度,分别在KB 和选择性KB 培养基上涂板,结果表明:细菌性果斑病病菌在KB 和选择性KB 培养基上长出的菌落生长速度一致,数量相当,且菌落数目呈梯度变化,说明选择性KB 培养基对细菌性果斑病标准菌株的生长无影响(图5)。

2.3 不同处理对种子萌发的影响

由表1 可知:处理3 对种子发芽率的影响较为明显,发芽率仅为87%,CK 和其他4 种处理的发芽率均在90%以上。 处理1 和处理4 的种子平均根长较CK 增长显著,处理5 与CK 无显著差异,而处理2 和处理3 的种子根长生长却受到明显抑制。

表1 不同处理对种子发芽的影响Table 1 Effects of different treatments on seed germination

3 结论与讨论

PCR 和实时定量PCR 检测结果表明:除处理5 外,CK 和处理1—4 均能检测到细菌性果斑病菌,但带菌程度不同,带菌量呈递减趋势。 用选择性KB 培养基进行涂板,可在很大程度上抑制杂菌的生长,但对细菌性果斑病菌的生长无明显影响。 活菌分离试验表明,只有CK 和处理1 的种子上能分离到细菌性果斑病菌。 发芽试验表明,只有处理2 和处理3 对种子的萌发和生长有抑制作用。 综合试验结果,处理5(70 ℃高温+包衣)既不影响种子发芽,又可有效杀灭细菌性果斑病菌,效果最佳。

另外,虽然处理2—4 的种子PCR 和荧光定量PCR 检测结果均显示阳性,但均未分离到活的细菌性果斑病菌。 究其原因,可能是带菌种子经过这3 种方式处理后,其携带的细菌性果斑病菌已被杀灭,但仍存在不同程度的DNA 残留,PCR 和荧光定量PCR 以残留的DNA 为模板进行扩增,所以呈现阳性结果。因此,在种子细菌性果斑病菌的检验检疫过程中,除了常规的PCR 检测或者血清学检测方法外,还应进行活菌分离或生长法来检测种子的带菌情况,这样检测的结果才更加准确可靠。