菜心BcSVP基因mRNA在异源嫁接体中的运输分析

陶 鹏，赵彦婷，岳智臣，雷娟利，李必元

(浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

嫁接是农业生产中一种常用的农艺技术，也是科学研究中的一种研究手段[1-2]。构建嫁接体是研究植物基因mRNA长距离运输的常用方法，基于不同物种中的直系同源基因之间的序列差异，可研究mRNA在穗砧中的上下运输[3]。利用拟南芥花序轴嫁接，通过RT-PCR检测到GAI的mRNA在穗砧之间进行了运输[4]。利用苹果树嫁接检测到IAA14基因的mRNA从砧木运输到接穗中[5]。此外，一些开花基因的mRNA也被证实发生了长距离运输。前人发现青花菜和拟南芥中AGL24的mRNA可在韧皮部中长距离运输，在砧木中超表达AGL24，会促进接穗提早开花[6]。SVP基因编码了一种MADS-box转录调控因子，在基因序列上与AGL24基因相似，但在调控开花时间上却呈现相反功能[7-8]。拟南芥的SVP基因会作用于顶端分生组织并降低赤霉素的生物合成来抑制开花[9]。SVP与AGL24共表达在花发育早期，参与调控花器官的分化[10-11]。而在序列上类似于AGL24的SVP基因的mRNA是否会像AGL24 mRNA通过韧皮部进行长距离运输还有待揭示，验证SVP基因mRNA长距离运输可为深入研究SVPmRNA运输的分子机制打好基础。

前期研究显示，结球甘蓝与菜心相互嫁接具有很好的亲和力[12]，是研究BcSVP的mRNA在结球甘蓝/菜心异源嫁接体中的长距离运输的前提条件。本研究基于结球甘蓝/结球甘蓝嫁接的接穗结球甘蓝茎尖和菜心实生苗叶片的转录组测序数据拼接获得了结球甘蓝BoSVP和菜心BcSVP的编码区序列和3’UTR序列。利用结球甘蓝和菜心SVP的种间差异序列，在异源嫁接体的接穗结球甘蓝茎尖的两个文库中筛选出了3条来自菜心的SVP基因的mRNA read。同时，比较分析了结球甘蓝/结球甘蓝嫁接和结球甘蓝/菜心嫁接中接穗结球甘蓝茎尖中内源BoSVP基因的转录表达情况。

1 材料与方法

1.1 结球甘蓝/菜心嫁接及转录组测序取样

将结球甘蓝G27与49菜心种子播于穴盘中，生长45 d后，将甘蓝G27的茎尖分别嫁接到49菜心的花序轴和结球甘蓝G27的茎上(对照组)。嫁接后30 d，对结球甘蓝/菜心嫁接体的甘蓝茎尖(T01和T02)和结球甘蓝/结球甘蓝嫁接体的结球甘蓝茎尖(T03和T04)进行取样，茎尖的长度约为2 cm，质量大约0.38 g。取样菜心实生苗的叶片(T05)。由百迈客公司完成RNA提取、转录组测序工作。

1.2 菜心和结球甘蓝SVP序列拼接

以白菜的BrSVP基因(Bra030228)序列作为参考序列，从菜心实生苗叶片的转录组测序数据(T05)中筛选菜心SVP的read，并拼接获得菜心SVP基因(命名为BcSVP)的编码序列以及3’UTR序列。再以BcSVP序列为准，找到其在甘蓝中的直系同源基因Bo4g149800。参考甘蓝Bo4g149800序列，从结球甘蓝/结球甘蓝嫁接的接穗结球甘蓝的茎尖T03的转录组测序数据中筛选获得结球甘蓝SVP基因的read，并拼接获得结球甘蓝SVP基因(命名为BoSVP)的编码序列和3’UTR序列。基于BcSVP和BoSVP的编码序列，翻译获得BcSVP和BoSVP蛋白的氨基酸序列，再使用ExPASy的在线软件Compute pI/Mw tool(http://web.expasy.org/compute_pi/)预测BcSVP和BoSVP蛋白质的相对分子质量和等电点。

1.3 从砧木菜心运输到接穗结球甘蓝中的BcSVP基因RNA read的识别与鉴定

由于BcSVP和BoSVP基因在3’UTR序列上有更大的差异，本研究在菜心BcSVP的3’UTR上选择了一段41 nt的序列CF(Caixin forward sequence)及其反向互补序列CR(Caixin reverse sequence)作为检索序列，使用UltraEdit软件在异源嫁接的接穗结球甘蓝茎尖T01和T02中筛选菜心BcSVP的mRNA长距离运输的read，并命名为Read1、Read2、……。为进一步验证从结球甘蓝中筛选出来的read是来自于菜心的BcSVP序列，筛选出的read的序列使用ClustalX[13]再次与BcSVP和BoSVP序列进行比对。如果read的序列与BcSVP序列一致，说明菜心的BcSVP的mRNA长距离运输到了接穗结球甘蓝中。

1.4 结球甘蓝内源BoSVP基因的转录表达分析

使用菜心BcSVP的CF及其反向互补序列CR可以从接穗结球甘蓝中筛选到发生长距离运输的BcSVP的mRNA read。而与CF和CR的相对应的结球甘蓝BoSVP的GF(Ganlan forward sequence)和GR(Ganlan reverse sequence)则可用来筛选结球甘蓝的BoSVPread。以GF和GR作为检索序列使用UltraEdit软件分别在T01、T02、T03和T04中进行筛选BoSVPread数量，可以排除T01和T02中外源菜心BcSVP的read，获得结球甘蓝内源BoSVP基因的read数量。再基于RPKM的计算方法获得结球甘蓝内源BoSVP基因的转录表达情况。计算公式为map到GF和GR序列上的read数除以map到基因组上的所有read数(以million为单位)与检索序列长度(以KB为单位)。使用Excel作图，其中横坐标为生物样品，纵坐标为RPKM。

2 结果与分析

2.1 菜心BcSVP和结球甘蓝BoSVP序列拼接及序列比较分析

使用白菜BrSVP基因(Bra030228)编码序列在公共数据库Ensembl Plants上检索，获得甘蓝的Bo4g149800基因序列。基于公共数据库的白菜SVP序列，从菜心叶片文库T05拼接获得了菜心BcSVP的编码序列。基于公共数据库的甘蓝SVP基因序列，从结球甘蓝/结球甘蓝嫁接的接穗结球甘蓝茎尖的文库T03中拼接获得了结球甘蓝BoSVP的编码序列。通过序列比对，菜心BcSVP和结球甘蓝BoSVP的编码序列高度相似，仅有8个碱基的差异(图1)。BcSVP和BoSVP蛋白在等电点和相对分子质量上都极其相近，为一类相对分子质量较小的酸性蛋白(表1)。

表1 菜心与结球甘蓝的SVP基因的同源基因、基因定位及其编码蛋白的等电点和相对分子质量

2.2 菜心BcSVP和结球甘蓝BoSVP基因种间差异序列的筛选

将菜心BcSVP和结球甘蓝BoSVP的编码序列进行比对，结果显示，BcSVP和BoSVP的编码区均有726个碱基，但两者之间仅存在着8个碱基的差异(图1)。而在BcSVP和BoSVP的3’UTR区， 240个碱基之间就有16个差异的碱基(图2)。相比于编码区，BcSVP和BoSVP的3’UTR区更适合筛选种间差异序列。为了尽可能避开选择性加poly(A)尾对筛选异源运输read的影响，本研究在菜心BcSVP的3’UTR上选择最靠近终止子的一段长为41nt的序列作为检测砧木菜心BcSVP的mRNA长距离运输的检索序列CF，考虑到测序结果中有正向和反向read，CF的反向互补序列CR也作为检索序列。同时在结球甘蓝BoSVP与CF和CR相对应的位置上选择一段40 nt的种间差异序列(GF和GR)，将作为分析接穗结球甘蓝茎尖的内源BoSVP转录本数量的检索序列。

起始密码子和终止子分别用下划线和方框表示。

终止子用方框表示，黑色背景显示的是检索序列GF的位置，而灰色背景显示的是种间差异序列CF的位置。

2.3 菜心BcSVP和甘蓝BoSVP基因mRNA运输的read的识别及验证

为分析菜心BcSVP基因的mRNA在结球甘蓝/菜心嫁接体中的长距离运输，使用CF和其反向互补序列CR序列在结球甘蓝/结球甘蓝嫁接体的结球甘蓝茎尖T03和T04中进行检索，结果没有检索到来自菜心BcSVP基因的read。而分别以CF和CR在结球甘蓝/菜心嫁接体的结球甘蓝茎尖T01和T02的转录组测序数据中进行检索。结果显示，CF在T01和T02中均没有检索到菜心的BcSVP基因的read。但使用CR进行检索，在T01和T02中分别获得2个(Read1和Read2)和1个read(Read3)(图3)。Read1和Read2分别位于T01文库中的34740498和76178478。而Read3则位于T02文库中的59545522。菜心Read1、Read2和Read3的长度均为150 nt(表2)。

图3 使用CR序列进行检索在异源嫁接体的接穗结球甘蓝茎尖T01和T02文库中检索到的三个潜在的菜心BcSVP read

为了证实在结球甘蓝中筛选出的3个read的确来自于菜心的BcSVP基因，本研究将Read1、Read2和Read3与BcSVP和BoSVP序列进行比对(图4)。Read1、Read2和Read3中分别有149、59和71个碱基位于3’UTR区。序列比对显示Read1与菜心BcSVP完全一致，Read2和Read3与菜心BcSVP序列相比分别存在着1个和3个碱基的差异(表2)。而Read1、Read2和Read3与结球甘蓝BoSVP序列相比分别存在着27、5、7个碱基序列的差异。说明使用CF与CR鉴定出来的运输read是从砧木菜心中运输到接穗结球甘蓝茎尖中的。

检索序列CF和CR用黑色背景标记。

表2 从异源嫁接的接穗结球甘蓝茎尖的T01和T02文库中识别的来自菜心BcSVP基因read的相关信息

2.4 结球甘蓝内源BoSVP基因在同源嫁接和异源嫁接的接穗结球甘蓝茎尖中的表达

为了解同源嫁接和异源嫁接对接穗结球甘蓝茎尖中BoSVP基因的表达影响，使用GF和GR序列(来自结球甘蓝的BoSVP基因的种间差异序列)分别在异源嫁接和同源嫁接的接穗结球甘蓝茎尖(T01和T02；T03和T04)的转录组测序的Raw data中进行检索，结果如表3显示，GF和GR在T01和T02中检索到的read数量之和明显多于在T03和T04中的数量之和。这些数据基于RPKM标准化后，显示结球甘蓝BoSVP在异源嫁接的茎尖T01和T02中的转录表达量分别为120.5和127.5，而在同源嫁接的茎尖T03和T04中的转录表达量分别为114.5和106.3，异源嫁接的接穗甘蓝中的BoSVP表达量略微高于同源嫁接的接穗甘蓝中的BoSVP表达量。

表3 不同种间差异序列在文库中检索到的数量

3 结论与讨论

使用菜心BcSVP中的种间差异序列，在异源嫁接的接穗结球甘蓝茎尖T01和T02中检索到来自菜心的BcSVPread，通过序列比对进一步证明异源嫁接的结球甘蓝茎尖T01和T02中识别的3个read来自于砧木菜心。在异源嫁接体的接穗结球甘蓝中的茎尖中出现菜心BcSVP的转录本read，说明菜心开花调控基因BcSVPmRNA从砧木菜心运输到了接穗结球甘蓝茎尖中。目前已报道多个基因的mRNA可进行长距离运输并且发挥功能，比如开花启动基因FT。拟南芥中FTmRNA可以从叶片通过韧皮部运输到茎尖，以调控光周期植物的开花[14]。青花菜中FVE基因的mRNA可在韧皮部中移动，在砧木中超表达FVE能促进接穗的提前开花[6]。砧木菜心AGL24的mRNA运输到接穗甘蓝的茎尖中[15]。因此，砧木菜心BcSVP的mRNA长距离运输也可能会调控接穗甘蓝的生长发育。

SVP和AGL24在序列上高度相似[7-8]，且两者mRNA均可长距离运输，暗示SVP和AGL24的mRNA长距离运输可能与特定序列或结构相关。最近研究显示一些基因序列在单链mRNA状态下可形成类似于tRNA的结构，这些mRNA会在韧皮部中富集，并通过嫁接结合处在接穗和砧木之间进行上下运输[16]。马铃薯StBEL5 mRNA可在韧皮部中运输，其3’UTR决定了其mRNA的稳定性及其运输到根的能力[17-18]。下一步识别和鉴定SVP基因mRNA运输的特定序列和结构，对于研究mRNA的长距离运输分子机制具有重要的意义。