基于微量元素分析的三七产地及其主侧根鉴别

张 棚，张 希，杨雪妍，刘元林，李 儒，龙 鸣，田晓静，*，张福梅，陈士恩，马忠仁

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院， 甘肃 兰州 730124； 2.西北民族大学 生物医学研究中心 中国—马来西亚国家联合实验室，甘肃 兰州 730030； 3.云南中医药大学 中药学院，云南 昆明 650500； 4.兰州海关综合技术中心，甘肃 兰州 730100)

三七又称“全不须”(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)，为五加科植物人参属的干燥根，具有凝血、抗三高、抗炎症等功能，以云南文山州为道地产地[1]。《中国药典》[2]规定三七饮片可直接以粉入药，但常有以其他产地三七假冒道地产地三七或以侧根、叶等掺杂至三七主根中[3]，三七粉剂中掺假尤为严重。三七掺假不仅会扰乱市场，还会对消费者健康带来潜在危害，因此三七产地及成分掺杂的检测具有重要意义。目前，三七品质检测时主要依据其外部感官性状进行判别[4]，如形状、直径、纹理、气味、色泽等(呈圆锥形，根长2～3.5 cm，上、下端直径0.6～0.8 cm，表面灰黄棕色或灰褐色，顶端周围有瘤状突起)，但要依赖于中医长期临床经验，且难以判别三七粉的掺假[5]。依据理化指标，如总皂苷[6]等指标，可以实现三七主根和侧根的鉴别[7]；童宇茹等[8]对三七粉掺杂品的DNA进行熔解曲线分析，实现了三七和大米、土豆等的鉴别；张艳美[9]通过感官判别，实现了具有感官特性三七的鉴别；此外，近红外光谱技术在三七粉中掺杂植物粉[10]、须根粉[11]及非道地产地[12]快速检测中也获得了较好的效果，可用于三七粉的真伪鉴定[13-14]；Yang等[15]以ITS2序列通过DNA条形码技术实现了三七和越桔根的有效鉴别，其根茎叶形态及其化学成分虽相似，但三七皂苷R1和人参皂苷含量不同。依据其理化指标可以对三七及其伪品进行鉴别。

基于Pb、Cd、As、Cu 4种重金属元素的含量，陶亮等[16]研究发现，云南不同地区三七中重金属的污染程度差异较大，故重金属含量可作为三七判别依据；金航等[3]利用ICP-AES对道地与非道地产区三七中微量元素进行测定，得出道地产区与非道地产区三七微量元素含量有显著差异，其中与文山(道地产区)三七相比Mn、Zn含量相对较高；刘明地等[17]利用原子吸仪光谱法(AAS)对云南、陕西、甘肃等13个产地进行12种微量元素分析，发现各产地12种微量元素差异显著；赵静等[18]采用湿法消解结合(ICP-AES)法对12个不同产地多个三七样品进行As、Cu等6种重金属元素的测定，对37个样品测定的结果进行聚类分析，发现12个产地三七微量元素含量具有相似性、差异性，可针对微量元素角度对三七进行系统的归类与判别；侯皓然等[19]基于微量元素含量角度，采用聚类、逐步判别等统计学方法对加拿大、美国、中国东三省的西洋参进行了产地鉴别，判别率100%。故依据微量元素对三七等中药材进行鉴别，方法科学、可行。

本研究拟建立基于电感耦合等离子体发射光谱技术(ICP-OES)同时测定Ca、Cu等11种金属元素含量的方法，并应用于云南5个不同产地三七主根和侧根中元素含量的检测，探讨多元统计分析方法在三七产地判别及部位判别中的效果，为三七产地追溯及掺杂植物粉、须根粉检测奠定理论基础，为市场监督三七品质提供方法基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及前处理方法

试验用三七样品分别于2017年11月采集于云南省文山州丘北县、红河州个旧市、曲靖市沾益县、曲靖市师宗县和曲靖市罗平县五个不同产地，每个产地采集40～50颗三七，设平行样本，重复3次。样本经干制后，分别将每个产地的主根和侧根粉碎(FS100S-3高速粉碎机，济南飞驰机械设备公司)过100目筛，密封保存于4℃冰箱待用(表1)。实验前采用干法消化后[20]过0.45 μm水系滤膜，待测。

表1 不同产地三七样品信息

1.2 试剂

Ca、Cu、Fe、Mg、Mn、Na、Zn(100 μg·mL-1)，Se、Cd、Pb、As(1 000 μg·mL-1)单元素标准贮备液，购于(北京)检验认证有限公司(北京，中国)；硝酸(GR)购于烟台市双双化工有限公司(烟台，中国)；超纯水(甘肃省膜科学技术研究院医药纯水设备)。

1.3 仪器与标准溶液系列浓度

电感耦合等离子体发射光谱仪(5110，安捷伦科技有限公司)主要工作参数：RF功率，1 200 W；等离子体气流量，12 L·min-1；辅助气流量，1 L·min-1；观察方式，SVDV；观察高度，8。标准系列浓度见表2。

表2 不同元素的标准溶液系列质量浓度

1.4 统计分析

实验数据采用Microsoft Excel 2010软件初步整理，利用SAS 9.4软件进行方差分析(analysis of variance，ANOVA)比较各产地以及其主侧根之间元素含量的差异性。通过SPSS 21软件，采用主成分分析(principal component analysis，PCA)、典则判别分析(canonical discriminant analysis，CDA)、聚类分析(clustering analysis，CA)、因子分析(factor analysis，FA)对三七样品基于微量元素分析进行产地判别。结果图由Origin 8.0绘制。

2 结果与分析

2.1 ICP-OES多元素检测方法的建立

2.1.1 标准曲线及其各元素检出限

以11次空白溶液中各元素含量计算标准偏差、检出限[21]回归方程和相关系数结果见表3。由表3可知，各元素标准曲线相关系数r值均在0.971 98～0.999 97，标准曲线在陈述浓度范围内，线性度较好；11种元素中检出限较低的为Cd元素(0.000 678 μg·L-1)；检出限较高的为Ca元素(0.719 574 mg·L-1)。其他介于0.000 678 μg·L-1到0.719 574 mg·L-1，检出限符合要求。

表3 各元素的回归方程及相关系数及其检出限

2.1.2 加标回收率、精密度、RSD值

根据GB 5009.268—2016[22]，按1.1节前处理样品，在1.3节中ICP-OES测定条件下，两次独立测定ZZ产地三七样品，判断其精密度(判别准则：含量>或<1 mg·kg-1，精密度<10%或20%)；再分别加入一定量的Ca、Cu、Fe、Mg、Mn、Na、Zn、Se、Cd、Pb、As单元素标准贮备液测定其样品浓度，经质量换算计算回收率，加标回收率=(加标后元素质量-加标前元素质量)/加标量[23]。结果精密度、加标回收率、RSD值[18]见表4。由表4可知， 所处理方法精密度良好，除As元素两次重复的绝对差值与算术平均值的比值略超过20%外，其他元素绝对值占算术平均值结果均在国家标准范围内。由于As元素本身属于极其微量的元素，且三七中As含量较低，低于检出限，导致As元素的精密度不理想；各元素加标回收率范围在95.72%～102.30%；各元素RSD值在0.09%～2.88%，均小于3%，所建立方法重复性良好。

表4 各元素加标回收率

2.1.3 不同产地及其主侧根三七元素含量

采用上述所建ICP-OES法检测表1中5个产地三七主、侧根粉11种元素含量，其结果及方差分析见表5。既然分析主根、侧根粉元素差异，就应该弱化产地，着重从主侧根元素差异分析。

由表5可知：对于三七同一产地主根与侧根而言，Fe、Na、Mn、Pb、As元素含量差异显著。各产地Fe、Mg、Na元素含量侧根均高于其主根；除曲靖市师宗县产地外，Mn元素含量侧根均高于其主根；重金属元素中，Pb元素含量侧根均高于其主根；除曲靖市师宗县产地外，As、Cd元素含量侧根均高于其主根。

表5 十种三七样品各元素含量测定结果与方差分析

于5种产地而言，不同产地之间Cu、Fe、Mn、Na、Cd、Pb、As元素含量差异显著，可以看出三七Mg、Fe、Ca、Na四种元素含量较高，Mn、Zn、Cu、Se、Cd、Pb、As六种元素含量相对较低。

于重金属元素含量而言，主根中重金属元素Cd含量最高的是ZZ产地，Pb、As重金属元素含量最高均为HZ产地。侧根三七中Cd重金属元素LC产地含量最高，Pb、As重金属元素HC产地含量最高。表5所有样品中Cd元素含量在0.29～3.98 μg·kg-1，Pb元素含量在0.33～17.32 μg·kg-1，As元素含量在0.89～6.44 μg·kg-1，Cd、Pb、As重金属含量均未超标[24-25]。HZ产地三七主侧根中Pb、As两种重金属元素含量比其他产地主侧根重金属含量都高。

2.2 基于多元统计分析的三七产地和主侧根判别分析

对11种元素组成含量进行PCA、CDA、FA、CA分析，其结果见图1～图4。

图1 不同产地三七主侧根PCA结果

2.2.1 基于PCA与CDA的三七产地的分析

由图1可知，前三个主成分的累积贡献率高达74.96%，包含了原始信息的大部分信息[26]。对于三七主侧根判别而言：5个产地的主根分布靠左，均落在左侧椭圆内；而5个产地的侧根分布在右侧椭圆内，没有区域重叠。三七产地主根与侧根区域分布在主成分1、主成分2水平上有明显的距离差(主根主成分1、主成分2<0；侧根主成分2>0)。PCA很好地实现了主根与侧根的区分。

对于三七5个产地间判别而言：主根在Prin3上呈现显著差异性，主根5个产地间没有区域重叠；侧根在主成分1、主成分2、主成分3均有距离的落差，彼此间分布没有区域的重叠。PCA很好地实现了三七5个产地间的区分。

由图2可知，同一个产地的重复性非常好，对于三七主侧根判别而言：5个产地主根分布在左下侧椭圆区域，侧根三七各产地分布在其他区域，没有区域的重叠，三七产地主根与侧根区域分布在特征值1、特征值2水平上有明显的距离差，CDA很好地实现了主根与侧根的区分。对于三七5个产地间判别而言：5个主根在特征值1、特征值2水平上落差较小，但依旧区分明显，没有区域的重叠；5个侧根在特征值1、特征值2水平上落差较大，产区间区分显而易见。基于元素分析，PCA、CDA结果呈现一致性，可以实现产地、主根和侧根的定性判别。为三七粉产地判别、以侧充主鉴别提供了高效准确的方法。

图2 不同产地三七主侧根CDA结果

2.2.2 基于FA的三七产地的分析

以5个不同产地三七主根和侧根中11种元素组成含量为输入，进行FA分析，并由Origi绘制loading图，见图3。在loading图中，Component1除Cu、Mg、Ca元素外，各元素变量比重均≥0.413，由As、Cd、Fe、Mn、Na、Pb、Se、Zn元素，8个变量解释，主变量因子即As、Fe、Pb元素；Component2中特征变量元素为Na 、Ca、Zn元素；结合表5，各产地间及其主侧根中As、Fe、Pb三种元素含量差距较大，特征规律明显，可直观看出各含量数量级差异的变化。在鉴别工作中优先选择As、Fe、Pb三种元素进行检测判别，可达到缩小检测元素范围的目的，使检测工作更为简单、快速、准确。

图3 三七各产地微量元素因子分析loading图

2.2.3 基于CA的三七产地的分析

以10种三七样品微量元素三次含量的重复值为输入进行聚类分析，采用组间连接(平方Euclidean距离)，标准化(Z得分)后进行聚类，结果见图4。由图4可知，当D3=2时5个产地及其主侧根均分类明显，同一产地的3次含量结果均首先聚类在一起，正确率100%；D1=22时，10种样品三七聚为2类，即主根和侧根，主根又可以在D2=10时分为三类，SC产地、HZ产地、其他主根产地，其中SC 产地被误判为主根类别。CA可实现对三七主与侧根的分类判别，准确率达到90%。CA分析证明，所选云南三七及其主侧根间微量元素含量具有差异性和相似性，通过计算其组间距离即可实现产地分类与判别，验证PCA、CDA的判别结果，与其具有高度一致性，错误率仅为10%。

图4 不同产地三七聚类分析树状图

3 讨论

目前越来越多的研究将微量元素作为评价三七药材道地性的指标之一[24]。本研究采用ICP-OES技术测定云南三七主侧根微量元素含量。刘明地等[27]利用AAS法测定13个产地三七12种微量元素，其r值在0.8673～0.992，低于本研究利用ICP-OES所得相关系数。本研究探讨了以干法消解结合ICP-OES同步检测三七中多种微量元素方法的精密度、RSD值等，该方法重复性好、精密度高。

本研究表明，不同产地Cd、Pb、As重金属含量差异较大，易受生长环境、土壤的影响，这与赵静等[18]在研究云南三七中重金属含量的规律具有相似性；金航等[3]研究发现，道地三七(文山州)Mn元素含量高于非道地产地，Cd重金属元素明显低于非道地产地，本研究中Mn、Cd元素同样呈现相同规律。

目前，对于三七主根与侧根的判别报道文章极少，王润云等[4]在三七及其易混淆品真伪鉴别分析中仅谈到利用支根上下端直径的大小和支根呈现的外形、颜色等作为判断依据。三七用作炮制品颇为频繁常见，多以三七粉的形式展现在人民群众的视线中，失去了原有的性状鉴别特点，此类伪品难以依靠感官检验分辨真伪，而对三七主侧根中微量元素规律的探究文章暂无。

赵恒强等[28]采用多元素分析结合PCA、LDA分析用于丹参产地的溯源，回判正确率为100%，为中药溯源提供方法支持；李成义等[29]基于Fe、Na等12种微量元素含量分析结合CA、FA分析对14个产地的板蓝根进行归属和鉴别，其方法科学、有效。本研究同样基于微量元素含量角度进行三七产地及其主侧根的溯源与鉴别，并结合PCA、CDA分析使5种产地三七得到区分，且各自主根与侧根也实现了区分，CA分析又系统地对三七主侧根进行了分类，并验证了PCA、CDA的判别结果，分类正确率90%。故此，基于三七元素分析，结合PCA、CDA、CA实现三七不同产地及其主根与侧根之间判别的目的，其判别方法科学、有效。

综上所述，本研究利用ICP-OES结合PCA、CDA、CA、FA分析方法实现了云南道地产地三七(文山)及其周边产地三七的主侧根及其产地间的判别，发现了不同产地三七及其主侧根元素含量具有显著的差异性，通过多元统计分析确立了不同产地三七及其主侧根判别数学模型依据，缩小了检测元素范围，对主根与侧根系统地进行了分类，通过微量元素含量的角度进行判别，结果与实际产地一致，为产地判别、掺假鉴别提供了一种高效准确的方法，为三七判别领域提供新思路。