柠檬酸在提高尿素呼气试验诊断幽门螺杆菌感染准确性中的作用

刘文忠

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所(200001)

1994年美国国立卫生研究院召开的全球首次幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)共识会议将消化性溃疡(胃溃疡、十二指肠溃疡)列为Hp根除指征。同年，世界卫生组织(WHO)将Hp感染列为胃癌第1类(肯定的)致癌原。鉴于Hp感染与慢性胃炎的关系符合Koch法则(判断病原体与疾病关系的“金标准”)，根除Hp有很大获益，2015年发布的《幽门螺杆菌胃炎京都全球共识》强调，Hp胃炎是一种感染(传染)性疾病，应治疗所有Hp感染者，除非有抗衡因素[1]。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，我国胃癌高危地区山东临朐和台湾马祖岛根除Hp预防胃癌的大样本长期随访研究[2-3]表明，根除Hp有望达到消灭肠型胃癌的目标。

目前我国Hp现症感染率约为40%～60%，Hp及其相关疾病负担沉重。根除Hp可起到“一石三鸟”的作用，即短期治疗(一石)可预防胃癌、预防和治疗消化性溃疡、预防和治疗Hp相关消化不良(三鸟)，具有很高的成本-效益优势[4]。预期在未来的20～30年中，检测和根除Hp仍将是消化系统疾病防控的热点。

准确诊断Hp感染是有效防控的前提，然而我国Hp感染检测的准确性仍存在不少问题。影响Hp感染诊断准确性的因素众多，本文就检测Hp感染的尿素呼气试验(urea breath test, UBT)中应用柠檬酸的重要性作专题论述。

一、UBT在Hp感染诊断中的重要性

UBT是Hp非侵入性检测中最重要的方法，经考核建立的方法敏感性和特异性均接近95%，因此被视为Hp非侵入性检测的“金标准”[5-6]。UBT检测无需行胃镜检查，核素标记的尿素口服后在胃内均匀分布，只要尿素接触部位存在Hp，就能被检测到，因而能克服Hp在胃内灶性分布会影响基于活检的检测方法准确性的问题[5-7]。

二、UBT检测Hp的原理

Hp可产生相对特异的尿素酶，后者可分解尿素产生NH3和CO2，UBT检测方法即利用了Hp的这一特性[5-7]。受试者口服核素(13C或14C)标记的尿素后，如胃内存在Hp，其产生的尿素酶可分解核素标记的尿素产生核素标记的CO2，后者弥散入血，经肺呼出。Hp感染者服用核素标记的尿素后约30 min，呼气中核素标记的CO2达到峰值。收集受试者服药前后(13C-UBT)或仅服药后(14C-UBT)呼出的气体，使用相应仪器检测呼气中核素标记的CO2，即可判断其是否有Hp感染。若无Hp感染，核素标记的尿素不被分解，则呼气中不含核素标记的CO2。13C为稳定性核素，13C-UBT检测结果以服药前后检测值的差值即超基准δ(delta over baseline, DOB)值表示；14C为放射性核素，14C-UBT的检测值以每分钟衰变(disintegrations per minute，dpm)表示。

三、影响Hp尿素酶活性的因素

Hp可产生丰富的尿素酶，后者分解尿素产生的NH3(碱性)是其抵御胃酸的主要手段。由此推测，胃内环境酸性越强，Hp的尿素酶活性越高。分子生物学研究显示，Hp 90%的尿素酶分布于胞质中，细菌周围的尿素通过由胞质膜上尿素转运蛋白(UreI)构成的通道进入菌体内激活尿素酶，方能被分解[8-9]。UreI通道的开放依赖于酸性环境，环境pH值越低，通过该通道进入胞质的尿素越多，因此该通道被称为氢离子门控尿素通道(H+-gated urea channel)[9]。基于上述发现，从严格意义上说，文献中报道的“低pH值可增加Hp尿素酶活性”并不正确，低pH值激活的是UreI通道而非尿素酶。但为了便于阐述，本文仍采用文献报道的概念。

四、UBT检测需排除其他产尿素酶细菌的影响

消化道中的产尿素酶细菌不仅仅只有Hp，奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌均能产生低丰度尿素酶[10-11]。因此UBT检测需排除其他产尿素酶细菌造成的假阳性。Hp主要定植于胃内，其产生的尿素酶量相对较大，活性维持需pH<6.0的环境；而其他产尿素酶细菌分布于口腔、胃和小肠，产生的尿素酶量相对较小，活性维持需pH>7.0[5,12]。

UBT检测方法中的一些设定可基本排除口腔、小肠中其他产尿素酶细菌的干扰[5,13]。①气体收集时间：一般定于口服核素后20～30 min。口腔和小肠其他产尿素酶细菌分解尿素产生的核素标记CO2多在1～10 min(口腔)和40～60 min(小肠)后呼出。②核素剂型：胶囊剂型将核素标记的尿素置于胶囊中，可避免核素接触口腔细菌，从而完全排除口腔细菌污染，但存在胶囊在胃内溶出缓慢、崩解不全的风险，粉剂/颗粒剂型则不存在这一风险。因此，不同剂型的核素各有其优缺点，在建立UBT检测方法时需排除缺点。

胃内其他产尿素酶细菌对UBT检测结果的影响不能通过设定气体收集时间或选择核素剂型解决，排除干扰主要依赖于Hp尿素酶活性所需的环境pH值不同于其他细菌。多数情况下胃内pH<6.0，因此可排除其他产尿素酶细菌的影响。但胃黏膜中-重度萎缩/肠化生(胃酸分泌减少或缺乏)或应用质子泵抑制剂(PPI)抑制胃酸分泌，可造成检测结果假阴性(pH>6.0，Hp尿素酶活性明显降低)[5,12,14]或假阳性(pH>7.0，其他细菌产生的尿素酶活性增加)[10-11]。

五、柠檬酸在提高UBT诊断Hp感染准确性中的作用

1.柠檬酸的应用背景：上文已述，UBT系针对Hp可产生相对特异的尿素酶而设计的Hp感染检测方法。尽管口腔、胃和小肠中存在一些其他产尿素酶细菌，但通过设定气体收集时间(排除口腔、小肠细菌)，加之一般胃内pH<6.0(排除胃内细菌)，基本上可排除这些细菌的影响。仍存在的问题是，中-重度胃黏膜萎缩/肠化生或服用PPI的患者胃内pH值可>6.0，PPI可停服，但中-重度萎缩/肠化生所致的低酸/无酸状态持续存在，就难以排除胃内其他产尿素酶细菌干扰造成的假阳性[10-11]。此外，胃内pH>6.0时，Hp本身的尿素酶活性下降，可能造成检测结果假阴性[13-14]。

如何解决胃黏膜病理状态下胃内pH值升高对UBT检测结果的干扰，成为提高UBT诊断Hp感染准确性必须解决的问题。早在UBT问世初期，就有不少学者对这一问题进行过探索。既然胃内pH值升高(低酸)会影响UBT检测结果，胃内酸化(acidification)无疑是解决这一问题的方法[13]。对不同酸化剂的比较研究[15]显示，在柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸等酸化剂中，柠檬酸效果最佳。因此柠檬酸成为UBT中被广为推荐的酸化剂。13C-与14C-UBT原理相同[6]，两者合用柠檬酸均能获益，但少有酸化剂用于后者的研究。

2.柠檬酸可降低UBT诊断Hp感染的假阴性率：13C-UBT的DOB值是判断是否存在Hp感染的关键参数。该方法的奠基人Graham教授(《Helicobacter》杂志主编)对12例Hp感染者的自身对照研究[16]发现，加用柠檬酸可使DOB值升高1倍以上，升幅与柠檬酸用量呈正相关。柠檬酸可升高DOB值的结果得到后续相关研究证实[17-18]。体外实验显示，pH值从7.0降至3.0，Hp尿素酶活性增加6倍，因此柠檬酸增加DOB值的主要机制为酸化作用[19]。

合用柠檬酸可提高13C-UBT检测的DOB值意味着可提高诊断敏感性，且不影响其特异性，因为无Hp感染者的DOB值不受柠檬酸影响[13]。提高敏感性以减少检测结果的假阴性，对根除治疗后以及胃黏膜中-重度萎缩/肠化生等细菌密度较低患者的Hp检出有益[5,13-14]。

3.柠檬酸可降低UBT诊断Hp感染的假阳性率：在高pH值(>7.0)条件下，胃内存在的其他产尿素酶细菌可造成UBT检测结果假阳性率显著增高。

自身免疫性胃炎以胃体萎缩为主，胃酸分泌减少或缺乏。在多次Hp根除治疗“失败”者中，自身免疫性胃炎的诊断率非常高。事实上，少部分多次根除治疗“失败”的患者并非真正的治疗失败，而是低酸或无酸导致UBT结果假阳性[20]。该情况同样见于胃黏膜中-重度萎缩/肠化生患者。上述情况下，合用柠檬酸可降低UBT检测的假阳性率[5,13,21]。

4.柠檬酸在UBT中作用的综合观点：一直以来，美国和欧洲国家供应的13C-UBT试剂中均加入柠檬酸，但亚洲国家供应的相关试剂尚无统一标准。中国香港[22]和韩国[18]的研究显示，加与不加柠檬酸对检测结果似无显著影响，但也有学者指出这些研究的可靠性存疑[23]。迄今为止，尚无加用柠檬酸反而干扰UBT检测结果的报道。柠檬酸价廉，口服无不良反应，因此Graham教授认为，总体上柠檬酸可增加UBT诊断Hp感染的敏感性和特异性，似乎没有理由不使用柠檬酸作为UBT的辅助剂[13]。