Elabela/APJ信号通路对子痫前期大鼠胎盘血管生成的影响

华诏召 李大娜 吴安芹 曹 婷 罗 实

贵州中医药大学第二附属医院(贵阳，550003)

子痫前期(PE)是一种以妊娠20周后新发高血压和蛋白尿为特征的全身性血管疾病，以高血压和蛋白尿为特征[1]。子痫前期是胎盘缺血性疾病，是由于子宫-胎盘血液循环障碍和胎盘功能缺陷，导致持续性胎盘缺氧而引发母体各种疾病表现[2]。G蛋白偶联受体(APJ)在人体内广泛表达，具有重要的生理功能，而Elabela是APJ的一个新的内源性肽类配体。Elabela可以促进血管生成，结合并激动APJ后进一步指引成血管系统发育成熟的基础[3]。降低子宫灌注压是通过手术使供应胎盘的血管狭窄，减少胎盘血供，接近PE的病理发生过程，是目前应用较广泛的一种模型，能成功模拟妊娠期高血压、蛋白尿等病理变化[4]。因此，本研究利用降低子宫灌注压建立子痫前期大鼠模型，探讨Elabela/APJ信号通路在子痫前期大鼠胎盘血管生成中的作用，为深入了解子癫前期的发病机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及试剂选择雌性SD大鼠20只，8～12周，体重200～220 g；雄性SD大鼠10只，体重280～300 g；购自中国科学院昆明动物研究所，合格证号：SCXK(滇)K2016-0001。适应性饲养1周。

1.1.2实验主要试剂戊巴比妥钠(北京华业寰宇化工有限公司)、RIPA裂解液、DAB显色试剂盒(均购自上海碧云天生物技术有限公司)、Trizol(Invitrogen公司)、血管内皮生长因子(VEGF)、人胚胎生长因子(PLGF)、β-actin普通PCR上下游引物(上海生工公司)、VEGF兔单克隆抗体、PLGF兔多克隆抗体、APJ兔多克隆抗体(美国Abcam)、Elabela兔单克隆抗体(Phoenix Biotech)、山羊抗兔二抗(美国LI-COR公司)、微量白蛋白ELISA试剂盒、肌酐(南京建成生物工程研究所)。

1.2 建立动物模型及分组

将SD雌鼠和雄鼠1:2合笼，次日早晨查见阴栓定为妊娠第1天。将受孕的16只雌鼠随机分为假手术组和模型组。合笼见栓后第14天，吸入异氟烷麻醉，沿中下腹正中线逐层切开腹腔至暴露并剥离出腹主动脉下端分支子宫动脉，于两侧子宫动脉置U形银夹，缝合切口，完成模型的建立[4]。假手术组仅分离腹主动脉与双侧子宫动脉，不置U形银夹，缝合切口。

1.3 观察指标

1.3.1手术前后大鼠血压采用BP-2000血压分析系统检测大鼠手术前后血压[5]。将大鼠固定于笼内加热袋，温度38℃预热10 min后，将鼠尾穿过加压感应器，固定于鼠尾根部。使大鼠尾动脉与加压感应器紧密接触，观察血压测量系统波形，波形稳定后测量血压。检测术前1d，术后1，7d大鼠血压，每次重复测量6次，测出收缩压和舒张压，获得平均动脉压，平均动脉压=(收缩压+舒张压×2)/3。

1.3.2手术前后大鼠尿蛋白含量测量血压同时收取大鼠瞬时尿液样本，分别使用尿白蛋白ELISA试剂盒和肌酐检测试剂盒进行尿白蛋白和尿肌酐测定。将尿白蛋白与尿肌酐的比值作为蛋白尿的判断标准。分别测定两组大鼠术前1d、手术后1，7d的尿微量白蛋白/肌酐比值。

1.3.3胎鼠、胎盘体质量检测孕21 d时戊巴比妥钠麻醉后剖腹取胎，检测胎鼠体和胎盘质量。尽快分离胎盘组织，液氮速冻，-80℃保存待用。

1.3.4大鼠胎盘Elabela、APJ、VEGF、PLGF的蛋白表达水平取胎盘加入RIPA 裂解液裂解后提取总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。每组按50 μg蛋白上样量经10% SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，用200 mA恒流转膜2 h至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗膜后加入一抗(1:1500稀释)，4℃孵育过夜，TBST洗膜后再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1:5000稀释)，室温孵育1 h后TBST洗膜。随后使用ECL化学发光法检测，于暗室成像拍照，以β-actin为内参，使用Image J分析软件计算各组大鼠胎盘中Elabela、APJ、VEGF、PLGF的蛋白表达水平。

1.3.5检测胎盘内VEGF、PLGF的mRNA表达水平Trizol法提取胎盘组织总RNA，逆转录获得cDNA，采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测各组VEGF、PLGF基因的表达水平。引物由上海生工公司设计合成，引物设计：VEGF上游5'-CCAGGAGTACCCCGATGAGATAG-3'，下游5'-CTGGCTTTGGTGA-GGTTGATC-3'；PLGF上游5'-ACGTGGAGCTGACGTTCTCT-3'，下游5'-CAGCAGGAGTCA-CTGAAGAG-3’；β-actin上游5'-ACCCCGTGCTGCTGCTGACCGAG-3'，下游5'-TCCCGGCC-AGCCAGCCAGGTCCAT-3’。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60 ℃退火30s，72℃延伸30 s，共40个循环，最后72℃延伸10 min。每组VEGF、PLGF基因的相对表达量按公式(2-△△Ct法)计算。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠血压

模型组与假手术组孕鼠均无死亡。与假手术组相比，模型组术后1d收缩压、舒张压及平均动脉压均显著升高(t=8.839，P<0.05；t=8.955，P<0.05；t=10.847，P<0.05)，术后7d也显著升高(t=27.332、16.266、23.681，均P<0.05)；而术前两组大鼠收缩压、舒张压及平均动脉压无差异(P>0.05)。与术前1天相比，模型组大鼠术后1d收缩压、舒张压及平均动脉压均升高(t=9.248、11.225、14.481，均P<0.05)；术后7d升高(t=24.241、17.044、26.274，均P<0.05)。见表1。

表1 两组大鼠手术前后血压比较

2.2 大鼠尿蛋白含量

与假手术组相比，模型组术后1d的尿白蛋白、尿白蛋白/尿肌酐比值均显著升高(t=51.386、17.131，均P<0.05)；术后7d也显著升高(t=52.819、28.282，均P<0.05)，而术前两组无差异(P>0.05)。与术前1天相比，模型组术后1d尿白蛋白、尿白蛋白/尿肌酐比值显著升高(t=43.743、17.330，均P<0.05)；术后7d也显著升高(t=60.238、27.294，均P<0.05)。见表2。

表2 两组大鼠手术前后尿蛋白含量比较

2.3 胎鼠体质量及胎盘重量

模型组孕鼠死胎率高于假手术组(χ2=22.442，P<0.05)；与假手术组相比，模型组胎鼠体质量及胎盘质量均显著降低(t=11.606、8.832，均P<0.05)。见表3。

表3 两组妊娠大鼠胎鼠体质量及胎盘重量

2.4 胎盘组织Elabela、APJ的蛋白表达水平

大鼠胎盘内Elabela、APJ的蛋白表达水平，与假手术组(1.00±0.10，0.96±0.09)相比，模型组(0.30±0.03，0.21±0.02)均显著降低(t=11.984、14.078，均P<0.05)。见图1。

图1 两组大鼠胎盘组织Elabela、APJ蛋白表达

2.5 胎盘组织VEGF、PLGF的表达水平

与假手术组相比，模型组大鼠胎盘组织VEGF、PLGF的蛋白表达水平显著降低(t=12.217、14.039，均P<0.05)，VEGF mRNA、PLGF mRNA表达水平显著降低(t=16.374、12.064，均P<0.05)。见图2、表4。

图2 两组大鼠胎盘组织VEGF、PLGF蛋白表达

表4 两组妊娠大鼠胎盘组织VEGF、PLGF蛋白和mRNA表达水平

3 讨论

子痫前期是一种多系统代谢性疾病，常伴有高血压和蛋白尿，是世界范围内孕产妇和围产儿死亡和发病的重要原因之一[6]。目前，子痫前期的病因和发病机制尚不清楚，构建理想的子痫前期动物模型可为相关研究提供良好的基础[7]。本研究根据文献，通过降低子宫灌注压建立子痫前期大鼠模型，结果发现，与假手术组相比，模型组术后1，7d的收缩压、舒张压、平均动脉压及尿白蛋白/尿肌酐比值均显著升高，与本组术前1d相比，术后1，7d均显著升高，提示本研究子痫前期大鼠模型建立成功。进一步检测胎鼠体质量及胎盘重量，发现模型组孕鼠死胎率高于假手术组，提示子痫前期孕鼠的胚胎发育不完全可能是造成母体损伤、胎鼠死胎率高且体质量降低的原因之一。

Elabela是APJ的内源性配体，是胎盘分泌的一种循环激素。Elabela基因敲除的妊娠小鼠表现出子痫前期样症状，包括蛋白尿和由于胎盘血管生成缺陷而升高的血压[8]。Elabela/APJ轴可能通过抑制血管紧张素转换酶表达和致病性血管紧张素II信号，保护压力超负荷诱导的心力衰竭[9]。研究报道，Elabela/APJ信号通路也可通过cAMP信号通路和ERK信号通路改变细胞内钙稳态从而促进血管生成[10]。此外，有研究发现，Elabela/APJ轴有助于胚胎发育，Elabela可激活APJ信号通路，诱导人脐静脉内皮细胞血管生成，使小鼠主动脉血管松弛，其可以通过降低妊娠期血压和蛋白尿水平预防子痫前期；但Elabela缺陷可导致胚胎发育缺陷[11-12]。本研究结果发现，与假手术组相比，模型组大鼠胎盘内Elabela、APJ的蛋白表达水平均显著降低。提示Elabela、APJ表达减少，Elabela/APJ信号通路功能被抑制，可能参与了子痫前期的发生发展。VEGF是一种重要的促血管生成因子，具有高度特异性的促血管内皮细胞分裂原，在刺激新血管的发生、生长及维持血管壁的完整性和通透性具有重要作用。如果血管内皮生长因子的表达减少，则会影响滋养细胞增殖和分化，导致滋养细胞的功能被抑制[13]。研究发现，子痫前期患者胎盘组织中VEGF水平较对照组显著降低，且随着病情的加重，VEGF表达水平逐渐降低，其在子痫发生以及病情演变中发挥重要作用[14]。PLGF属于血管内皮生长因子中的一种，是调节胎盘滋养层细胞的重要物质，在早孕期对滋养细胞增殖与分化具有促进作用，确保胎盘血管网络形成充分[15]。有研究报道，孕妇血清中PLGF浓度与子痫前期的发病具有相关性，对子痫前期的发生具有良好的预测价值[16]。黄凤凤等[17]研究发现，子痫前期孕妇血清PLGF水平显著降低，且病情严重者PLGF水平下降更明显。Ho等[18]用Elabela刺激人胚胎干细胞时发现转化因子β1(TGF-β1)的表达增加，能够促使Smads磷酸化并与其他转录因子诱导VEGF表达，从而促进血管生成[19]。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠胎盘组织VEGF、PLGF的蛋白表达水平及其mRNA表达水平均显著降低。提示子痫前期孕鼠胎盘组织中VEGF及PLGF的表达降低导致血管生成异常，进一步促进子痫前期的发展。其可能与Elabela/APJ信号通路被抑制有关。

综上所述，子痫前期孕鼠胎盘组织内Elabela、APJ表达减少，Elabela/APJ信号通路功能被抑制，其可能通过抑制VEGF及PLGF在胎盘中的表达参与子痫前期的发生发展。但Elabela/APJ信号通路如何调控VEGF及PLGF的表达及其具体作用机制仍有待进一步研究。