血管生成因子A抑制剂对子宫内膜异位症模型大鼠干预效果及作用机制研究

张忠元 易 蕾 杨晓艳

武汉科技大学附属天佑医院(430060)

子宫内膜异位症主要是由活性内膜细胞在机体子宫内膜之外种植而导致[1]。临床表现为痛经、不孕、月经异常、尿频腹泻等，对患者生育能力和妊娠造成严重影响[2]。目前发病机制尚未明确，多数学者认为与血管生成及充足的血供有密切联系，抗血管生成是治疗子宫内膜异位症的关键[3-4]。血管生成因子(VEGF)家族中VEGF-A，在血管生成过程中发挥着重要作用。目前国内外关于靶向VEGF-A对子宫内膜异位症进行干预研究鲜有报道，本文研究建立了子宫内膜异位症大鼠模型，使用VEGF-A抑制剂进行干预，探究对子宫内膜异位症模型大鼠的干预效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1研究动物选取35只SD健康雌性大鼠(广西医科大学实验动物中心提供)，鼠龄(5.8±1.5)月(4～8月)，体重(231.5±15.7)g(210～250g)；均养殖在干净笼里，室温23.1±1.8℃，相对湿度35%～40%，每天光照12h，喂饮纯净水，饲养1周。本文研究实验均获得本院伦理委员会批准。

1.1.2主要试剂大鼠抗小鼠雌激素(E2)、孕酮(P)抗体(Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成素(LH)抗体(Sigma公司)；大鼠抗兔VEGF、HIF-1α抗体(Dako公司)；兔抗大鼠CRP、IL-8、IL-6抗体(Selleck公司)；兔抗大鼠Bcl-2、Bax抗体(Gibco公司)；兔抗小鼠caspase3抗体(Hyclone公司)。

1.2 建模及分组

随机取5只大鼠不做任何处理作正常组，余30只大鼠建立子宫内膜异位症模型：对大鼠注射苯甲酸雌二醇使其发情，麻醉处理后固定，腹部备皮消毒，在尿道口上方10mm做一2cm垂直切口开腹，显露膀胱下子宫组织，近端于距宫角10mm处位置结扎，远端距卵巢20mm位置结扎，摘除子宫并使用磷酸盐缓冲液清洗，子宫切开后剥除浆膜层、肌层，将子宫内膜切成4mm×4mm大小植入大鼠皮下筋膜与腹肌之间后关腹。喂养20d后再次开腹观察异位内膜组织生长情况。建模成功标准：移植物囊性增大，囊壁出现新生结缔组织和血管，囊泡中出现黄色液体。最终建模成功28只，将28只子宫内膜异位症大鼠随机分为模型组10只以及丹那唑组、VEGF-A抑制剂组各9只，丹那唑组大鼠使用丹那唑溶液灌胃处理，VEGF-A抑制剂组大鼠使用VEGF-A抑制剂灌胃处理，正常组、模型组大鼠使用生理盐水灌胃处理。禁食5h后取所有大鼠尾部静脉血清，-70℃保存待检。各组大鼠发情期麻醉断头法处死，摘取正常组大鼠左侧子宫及子宫内膜异位症模型大鼠异位内膜组织，液氮冷冻后甲醛浸泡固定行组织切片，免疫组化染色。

1.3 激素测定

免疫透射比浊法检测各组血清E2、P、FSH、LH水平，波长340～700nm处读吸光度并计算。酶联免疫吸附实验检测血清CRP、IL-8、IL-6水平，按照试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)说明书检测。

1.4 蛋白表达

使用Western blot法检测。PBS缓冲液清洗内膜组织标本3次，分离缓冲液后裂解0.5h，测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，加入适量SDS-PAGE蛋白缓冲液后电泳10 min，在10%牛奶中浸泡电转膜，摇床上常温封闭1.5 h；与一抗结合之后使用TBST稀释并孵育保存；次日使用TBST液清洗，与二抗结合后常温孵育1 h，再次清洗，加入显影剂显色，检测VEGF、HIF-1α、Bcl-2、Bax、caspase3相对表达量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血清性激素水平对比

大鼠血清E2、P、FSH、LH水平，正常组<丹那唑组

表1 各组大鼠血清性激素水平对比

2.2 各组大鼠血清因子水平对比

大鼠血清CRP、IL-8、IL-6水平，模型组最高，正常组最低，VEGF-A抑制剂组低于丹那唑组(均P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清因子水平对比

2.3 各组大鼠VEGF、HIF-1α相对表达量对比

如表3、图1(见封三)、图2(见封三)所示，VEGF、HIF-1α相对表达量模型组高于正常组；丹那唑组、VEGF-A抑制剂低于模型组，且VEGF-A抑制剂组低于丹那唑组(P<0.05)。

2.4 各组大鼠内膜组织中蛋白相对表达量对比

如表4所示， Bcl-2、caspase3相对表达量模型组高于正常组，Bax相对表达量低于正常组(P<0.05)。丹那唑组、VEGF-A抑制剂组Bcl-2、caspase3相对表达量均低于模型组，Bax相对表达量高于模型组，且VEGF-A抑制剂组Bcl-2、caspase3相对表达量低于丹那唑组，Bax相对表达量高于丹那唑组(均P<0.05)。

表3 各组大鼠VEGF、HIF-1α相对表达量对比

表4 各组大鼠内膜组织中蛋白相对表达量对比

3 讨论

雌激素水平的变化与子宫内膜异位症发生发展、异位内膜组织的生长密切相关[5]，是内分泌失调重要的检测指标[6]。P具有保护子宫内膜作用[7]。FSH对卵巢发育起到促进作用[8]。LH能引起排卵并生成黄体[9]。本文研究结果显示，相比正常大鼠，子宫内膜异位症大鼠E2、P、FSH、LH水平均异常上升，药物干预后明显下降。分析原因可能是使用VEGF-A抑制剂干预，促进大鼠异位子宫内膜组织的生长，使E2、P、FSH、LH水平下降。

研究表明，子宫内膜异位症的发生发展通常伴随着炎症反应[10]。CRP在人机体出现炎性反应、肿瘤以及组织损伤时呈现高表达，属急性期反应物，临床常被用作检测炎性反应以及免疫防御功能的标志物[11]。魏顺英[12]等研究，CRP在子宫内膜异位症患者血清中呈现异常高表达，与子宫内膜异位症的病情发展及严重程度有一定相关性。IL-8可激活中性粒细胞，并释放一系列活性产物，导致机体局部炎症反应，达到杀菌和细胞损伤目的[13]。IL-6参与多种炎症反应和疾病，是一种重要的促炎因子，还能够促进免疫细胞的增殖和分化，并提高其免疫功能。有研究表明，随着人体健康程度提升，IL-6在人体水平会出现一定程度下降[14]。朱定军[15]等研究认为，IL-8、IL-6与子宫内膜异位症发生发展密切相关，其水平对异位症诊断和疗效评价具有重要意义。本研究结果显示，子宫内膜异位症大鼠CRP、IL-8、IL-6水平较高，使用VEGF-A抑制剂干预后出现明显下降，说明炎症反应减轻。分析原因可能是抑制剂抑制了异位内膜组织的炎症发展，从而减轻炎症反应。

VEGF、HIF-1α与机体组织血管生成具有密切联系。HIF-1α大量存在于哺乳动物细胞中[16]。VEGF具有提升机体血管通透性、促进机体血管形成作用[17]。本文研究结果显示，使用VEGF-A抑制剂对大鼠异位内膜组织VEGF、HIF-1α表达明显抑制，说明抑制了VEGF、HIF-1α的表达，抑制了异位内膜组织的血管生成，从而起到干预效果。

有学者在研究中表示，促进异位内膜组织凋亡是治疗子宫内膜异位症的关键[18]。Bcl-2、Bax、caspase3的表达与细胞凋亡密切相关[19]。有学者研究，caspase家族与细胞凋亡密切相关，caspase3是caspase家族的重要一员，是诱发细胞凋亡的关键[20]。本文研究结果显示，使用VEGF-A抑制剂对子宫内膜异位症大鼠干预，Bcl-2、caspase3表达出现下调，Bax表达出现上调，说明通过调控Bcl-2、Bax、caspase3表达，促进了异位内膜组织的凋亡。

综上所述，使用VEGF-A抑制剂对子宫内膜异位症模型大鼠干预，能够调控性激素分泌，抑制炎症反应和异位内膜组织生长，促进异位内膜组织凋亡。