二代测序技术在骨髓增生异常综合征基因突变检测中的应用进展

王笑然，周虎，丁冰洁，刘建平，徐佩佩

（郑州大学附属肿瘤医院，河南 郑州）

0 引言

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是一种以造血细胞异常增生、外周血细胞减少和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)易感性为特征的克隆性血液学疾病。细胞遗传学历来在MDS 的诊断和预后中发挥重要作用，已有多个基因被发现与MDS 的疾病类型相关，而对这些基因突变的了解为定义的MDS 亚型提供了思路，同时也有助于开发治疗MDS 的新疗法。二代测序技术在MDS 诊断、预后和监测中的确切作用尚不清楚，本文将就二代测序技术在MDS 基因突变检测中的应用进行介绍。

1 二代测序在MDS 诊断和分型中的应用

在2016 年修订的2008 年WHO 指南中，对MDS 亚型进行了重新定义，强调了分化异常的细胞程度和百分比的地位。染色体核型信息的加入能使反应性细胞减少或细胞异常与真正的MDS 更容易区分。当患者出现原因不明的细胞减少症和MDS 临床表现一致，但不完全符合细胞形态学标准时，某些细胞遗传学异常，如del(7q)、t(2;11)(p21;q23)可作为确诊的依据。然而，并不是所有的MDS 病例都有可识别的核型异常。高达80%的复发MDS 患者都存在异常染色体核型，但不到50%的初诊MDS 患者可检测到核型异常。通过二代测序检测基因突变有助于进一步区分MDS 亚型。伴环形铁粒幼红细胞增多的MDS 患者中，70%-80% 的病例中存在SF3B1 突变，尽管MDS 伴环形铁粒幼红细胞增多(MDSwithringsideroblasts, MDS-RS) 的诊断依据骨髓形态学中被要求为至少达到15%的环形铁粒幼红细胞，但在SF3B1突变的情况下，仅需要5% 的环形铁粒幼红细胞即可做出诊断。SF3B1 突变患者的临床和形态学特征可能不同, 但SF3B1 与较低的骨髓细胞百分比、较高的中位血小板计数、较高的白细胞计数和较高的中性粒细胞计数之间存在相关性[1]。SF3B1 基因突变成为MDS 亚型的诊断依据，正是基因突变在MDS 诊断和分型中的重要临床价值的体现,其他基因的突变状态对MDS 的鉴别诊断也有一定的价值,目前在指南中作为推荐选做检测项目, 包括TP53、TET2、DNMT3A、IDH1/2、EZH2、ASXLl、SRSF2、RUNXl、U2AFl、SETBPl 等。二代测序技术的应用，会使越来越多的基因突变在MDS 的诊断和分型中发挥重要作用。

2 二代测序在MDS 危险度分层中的应用

IPSS 和IPSS-R 是目前最广泛使用的MDS 预后评分系统，但也有部分患者的预后与他们的风险评分不一致。其中一些差异可以用基因突变来解释。例如，低风险的del(5q) MDS 患者倾向于对利那度胺有良好的反应，向AML 进展的更少，但高达20%的del(5q)患者在诊断时被发现存在TP53基因突变。一项针对944 名MDS 患者的大型研究发现了14 个具有预后意义的基因[2]。在这组基因中，TP53、ETV6、RUNX1、EZH 和ASXL1 的突变已被证实为不良预后的独立预测因子。其他研究还发现，SRSF2 还可作为不良预后的独立预测因子[3]。值得注意的是，将这些基因与传统的IPSS-R模型相结合，能够比仅基于IPSS-R 或仅基于突变的模型更准确地预测患者生存期[2]。当骨髓原始细胞低于5% 时，SRSF2、U2AF1 和ASXL1 突变与较短的生存期相关，但在较高的原始细胞负荷下却无有价值的相关性[4]。将预后模型扩展到接受过多种治疗的患者和继发性MDS 患者也是一个重点。在建立了年龄、IPSS-R 评分、EZH2、SF3B1 和TP53突变与生存期的独立相关性后，比单独使用IPSS-R 更准确地预测患者的生存期。重要的是，该模型评估了初治和复发MDS 患者，并在接受多种治疗的患者中得到了验证。另一项针对亚洲原发性MDS 患者的研究，将5 个与较短生存期相关的独立基因(DNMT3A、TP53、ASXL1、IDH2 和CBL)的突变状态纳入一个新的模型。在WHO2016 年分类组和IPSS-R类别中，具有这些突变的患者的生存期较短，与处于下一个高风险类别的患者具有明显差异[5]。随着越来越多的研究探索突变状态在预后评分中的作用，如何调整IPSS-R 以纳入基因信息和复合突变MDS 的生物学复杂性将变得更加清晰。

3 二代测序在MDS 治疗中的应用

虽然许多新的治疗方法正在研发中，但只有三种药物——来那度胺、阿扎胞苷和地西他滨被食品和药物管理局(FDA) 批准用于治疗MDS，而且自2006 年以来没有新的药物被批准。无临床表现及IPSS-R 评分较低的患者常常被忽略，直到他们因血细胞减少而出现症状或疾病发生进展才被诊断。低风险性贫血常通过输血和促红细胞生成素(erythropoiesis-stimulating agents，ESAs)来治疗。疾病进展、伴del(5q)且对来那度胺耐受的患者，可以使用去甲基化药物(DNMTIs)，如阿扎胞苷或地西他滨进行治疗。异基因造血干细胞移植（Allo-HSCT）是唯一可治愈MDS 的方法，但大多数患者不符合移植条件[6]。

来那度胺可用于治疗伴del(5q) 的MDS 患者，当伴有TP53 基因突变时可能预示着来那度胺治疗失败或进展为AML。将二代测序用于指导ESAs 的使用尚未得到充分的研究。在一项对79 例接受ESA 治疗的低危MDS 患者研究中发现，最常见的基因突变是SF3B1、TET2、ASXL1 和DNMT3A，进行单因素分析发现，超过两种突变与红细胞反应性降低显著相关，然而在多因素分析中则发现，突变的数量或类型与红细胞反应性降低之间没有明显的相关性[7]。将二代测序用于指导去甲基化药物应用值得探究。阿扎胞苷是首个通过随机试验明确对MDS 有效的药物，但是只有一半的患者对该药有反应[8]。有研究发现TET2 突变可以提高药物反应率，而DNMT3A 突变与药物不良应答之间存在相关性，但是没有进一步的研究来支持这些结论[9]。然而，体细胞基因突变可以预测治疗反应的持续时间，DNA 甲基化调节因子的突变和3 个或3 个以上突变的存在与去甲基化药物反应时间的缩短有关。一项回顾性研究表明，TP53 突变患者对去甲基化药物的应答时间明显较短，大约为6 个月，但是该研究没有发现基于TP53 突变状态的总体应答率的差异[10]。相反,Welch 等[11]发现，在接受地西他滨治疗的MDS/AML 患者中，TP53 突变的患者能够更快的清楚骨髓异常原始细胞并且具有比预期更长的生存率, 但是这些结果只在21 例完全缓解率为19% 的TP53 突变患者中发现。其他关于TP53 突变患者对去甲基化药物反应的研究并没有一致证明地西他滨优于阿扎胞苷。因此，还需要进一步研究来明确TP53 突变对去甲基化药物治疗反应的影响。

基因突变状态，尤其是TP53 的突变状态，可能有助于预测Allo-HSCT 患者的预后[12]。虽然TP53、TET2、DNMT3A、RUNX1 和ASXL1 的突变被认为是Allo-HSCT 后生存期缩短的指标，但TP53 是唯一一个独立的预测因子，可以预测各组间的生存期缩短。而在MDS/MPN 中，RAS 途径突变可以预测到较短的生存期，RAS 途径突变和TP53 突变均与Allo-HSCT 后复发时间较短有关。根据对797 例MDS 移植患者的研究发现，移植患者TP53 突变的不良预后可能与复杂核型有关，与复杂核型患者相比，无复杂核型的TP53 突变患者移植后生存期显著延长。但是目前仍不清楚这是否与患者的非复发死亡率相关。二代测序可能有助于监测疾病残余和预测移植后的复发。与其他研究一样，RAS 途径、RUNX1和ASXL1 的突变与Allo-HSCT 后的死亡风险没有显著相关性。此外，这些基因的突变与移植后疾病进展的风险之间没有显著的联系。持续存在的突变可能与移植效果差有关的观点有待进一步验证。

4 存在的问题及未来展望

在MDS 中通常发生突变的基因并不是MDS 特有的。例如，TET2 和DNMT3A 的体细胞突变可以在所有的髓系肿瘤和淋系疾病中看到，SF3B1 的突变也可以在骨髓增殖性肿瘤（MPN）和慢性淋巴细胞白血病中看到。此外，在健康人群中也可发现细胞突变。研究报告显示，高达79%的MDS 患者在NGS 靶板上发现突变,二代测序具有巨大的潜力，可以帮助临床医生在观察突变频率、治疗药物的选择、其他合并症的评估以及评估预后的能力等方面做出决策。随着二代测序技术的不断进步，MDS 基因突变的种类被发现的越来越多，对预后和疾病的分类有着巨大的贡献。对这些突变的了解为靶向治疗的研发提供了依据和思路，利用二代测序来检测变异频率低的等位基因突变，可以针对这些遗传缺陷来进行治疗。然后，对二代测序结果的解读也是一个挑战，不同的突变基因有着不同的突变位点和类型，这些在疾病的诊断和治疗中是否有一定影响尚待进一步明确。标准化二代测序方法和变量调节，以提高数据的完整性也是二代测序在MDS检测中的重要挑战。