Vash1、Ki67、CD34在声带白斑组织中的表达及临床意义

高志光 安 然 蒋杏丽 金 梦 焦 慧 李 峰 刘 铮 李明华

声带白斑(vocal cord leukoplakia)是临床中的描述性诊断，是指在宏观检查中发现黏膜表面的白色斑块。声带白斑包括多种病理变化，如过度角化、异型增生、原位癌和浸润癌[1]。研究表明，临床诊断为声带白斑的病例中有6%～7%的患者可能进一步发展为癌症[2]。相比于诊断为非异型增生的白斑，诊断为异型增生的白斑是潜在的癌前病变[3]。在头颈部鳞状细胞癌患者中，血管生成抑制蛋白 VASH1(vasohibin-1)高表达的患者比低表达的患者无病生存期明显缩短，VASH1的表达与肿瘤的进展有关，可能是头颈部鳞状细胞癌的预后指标[4]。Ki-67在喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)组织中的表达明显高于癌旁组织，高表达的Ki-67可能是LSCC预后的预测指标[5]。在喉癌组织呈高表达的CD34可能成为喉癌早期诊断的指标[6]。目前Vash1、Ki67、CD34对声带白斑的作用机制尚未明确。本研究应用免疫组织化学染色法，研究Vash1、Ki67、CD34在声带白斑中的表达，及其与声带白斑复发和癌变之间的关系。

材料与方法

1.标本来源：选择2018年1月～2019年12月在黑龙江省医院耳鼻喉科住院接受支撑喉镜下声带白斑切除术、支撑喉镜下声带息肉切除术患者共100例，其中声带白斑50例，声带息肉50例。所有患者术前均无头颈部放疗、化疗及免疫治疗史，无气管插管、喉部手术史、外伤史，无全身其他部位恶性肿瘤，术后病理结果均由病理医师严格确诊。

2.方法：术中切除的病变标本常规用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，给予连续切片，厚度4μm。抗体包括兔抗人Vash1多克隆抗体、鼠抗人CD34单克隆抗体、鼠抗人Ki67单克隆抗体。应用链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase, S-P)免疫组织化学染色法，检测声带白斑和声带息肉组织中Vash1、Ki67、CD34蛋白的表达。根据病理表现，将声带白斑组和声带息肉组分为两个亚组，即非异型增生组和异型增生组，分析两亚组间Vash1、Ki67、CD34的表达情况。

3.结果判定：在声带白斑和声带息肉组织中，Vash1阳性细胞表现为细胞质呈棕黄色颗粒状着色，Ki67阳性细胞表现为细胞核呈棕黄色。选择细胞染色清晰的组织切片，在光学显微镜下，随机选取5个高倍镜(×400)视野，在每个视野中计数阳性细胞，计算阳性细胞所占的百分率。根据阳性细胞在病变的上皮细胞总数中所占的比例，确定阳性范围：阳性细胞数<5%为阴性(-)，阳性细胞数5%～25%为弱阳性(+)，阳性细胞数26%～50%为阳性(++)，阳性细胞数>50%为强阳性(+++)[7]。CD34表达于血管内皮细胞，其胞质经染色后呈棕黄色则为CD34阳性。参照Weidner[8]标准对微血管进行计数，在低倍镜(×100)下，找到微血管分布集中处，选取5个不重复的高倍镜(×200)视野，对微血管进行计数，取其平均值作为微血管密度值(microvessel density, MVD),即CD34-MVD值。

4.复查与随访：对50例声带白斑和50声带息肉患者进行手术后复查和随访，时间为术后1、3、6、12个月，截止到2019年12月30日，复查时行电子喉镜检查，观察是否出现复发，复发患者再次住院手术治疗，切除标本送病理检查，观察是否出现癌变。

结 果

1.Vash1在声带白斑和声带息肉组织中的表达：Vash1在声带白斑和声带息肉组织中的阳性表达，均表现为细胞质呈棕黄色颗粒状染色，两组中的阳性表达率分别为82.00%(41/50)和74.00%(37/50)，差异无统计学意义(χ2=0.932，P=0.334)，详见表1。在声带白斑组内，非异型增生组与异型增生组间Vash1的表达比较，差异无统计学意义(χ2=0.709，P=0.400)，声带息肉组内，两亚组间Vash1的表达比较，差异无统计学意义(χ2=0.002，P=0.962)。

表1 Vash1在声带白斑和声带息肉组织中的表达情况

2.Ki67在声带白斑和声带息肉组织中的表达：Ki67阳性细胞表现为细胞核呈棕黄色，在声带白斑和声带息肉组织中表达的阳性率分别为84.00%(42/50)和58.00%(29/50)，差异有统计学意义(χ2=8.208，P=0.004)，详见表2。在声带白斑组内，非异型增生组与异型增生组间Ki67的表达比较，差异有统计学意义(χ2=4.303，P=0.038)，声带息肉组内，Ki67在两亚组间表达比较,差异无统计学意义(χ2=0.516，P=0.473)。

表2 Ki67在声带白斑和声带息肉组织中的表达情况

3.CD34在声带白斑和声带息肉组织中的表达:声带白斑和声带息肉组织中，CD34-MVD值分别为18.593±4.455和10.089±2.565，差异有统计学意义(t=11.697,P=0.000，表3)。在声带白斑组内，非异型增生组和异型增生组CD34-MVD值分别为16.612±2.267和20.919±4.597，差异有统计学意义(P=0.000)。在声带息肉组内，非异型增生组和异型增生组CD34-MVD值分别为9.802±2.348和13.388±3.001，差异有统计学意义(P=0.029)。

表3 CD34在声带白斑和声带息肉组织中的表达情况

4.Vash1、Ki67、CD34之间表达的相关性分析：在声带白斑病例组中，Ki67阳性率和CD34-MVD值之间呈正相关(r=0.526，P=0.000)，Vash1和Ki67阳性率之间呈低等程度正相关(r=0.378，P=0.007)，Vash1阳性率和CD34-MVD值之间不相关(r=0.259，P=0.069)。

5.Vash1、Ki67、CD34在声带白斑复发和癌变病例中的表达：50例声带白斑病例的随访中，有2例(4.00%)在随访第12个月时因电话停机失访，2例(4.00%)随访时间不足12个月，在随访期内未出现复发和癌变。46例声带白斑病例中，共11例(23.91%)在随访期间复发，随访第3个月复发1例(2.17%)，第6个月复发3例(6.52%)，第12个月复发7例(15.22%)。按照是否复发，将46例声带白斑患者分为复发组和未复发组，两组间Vash1的表达比较，差异无统计学意义(P=0.075)，Ki67在两组间的表达比较，差异有统计学意义(P=0.000)，CD34-MVD值在两组间的表达比较，差异有统计学意义(P=0.007)。46例声带白斑病例中，2例(4.35%)在随访第12个月时出现癌变，以是否出现癌变将46例声带白斑患者分为癌变组和未癌变组，Vash1在两组间的表达比较，差异有统计学意义(P=0.019)，Ki67在两组间的表达比较，差异有统计学意义(P=0.023)，CD34-MVD值在两组间的表达比较，差异无统计学意义(P=0.085)。

讨 论

声带白斑的病理表现呈多样性，按照2005年世界卫生组织(World Health Organization, WHO)修订的头颈部肿瘤分类标准,具体病理分类为非异型增生、轻度异型增生、中度异型增、重度异型增生、癌症，2017年WHO蓝皮书中引入了两级分类，如“无/轻度异型增生”为低风险，“中度或重度异型增生”为高风险[9]。Vash1主要表达于血管内皮细胞中，并起到终止血管生成的作用，由血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2, FGF-2)等血管生成刺激因子诱导[10]。在喉癌组织中的VEGF的表达明显高于癌旁组织和正常喉黏膜组织[11]。在癌症组织中，Vash1的表达强度与VEGF的表达强度呈正相关[10]。高表达的Vash1与头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、食管鳞状细胞癌等恶性肿瘤的预后不良有关[4,10,12～14]。Ki67是一种脱氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid, DNA)结合蛋白，主要位于细胞核，与细胞增殖密切相关。Ki67可能参与喉癌的癌变过程，在LSCC组织中的表达明显高于邻近非肿瘤组织，它可能是预测LSCC预后有价值的指标[5]。CD34是一种单链高度糖基化型跨膜蛋白，存在于微血管内皮细胞，能促进新生血管的形成[15]。一项对72例LSCC患者的研究表明，CD34在LSCC组织中高表达，对LSCC的早期诊断和预后的判断有重要意义[6]。

本研究发现,Ki67和CD34在声带白斑组织中高表达，其中异型增生组比非异型增生组的表达更高，Ki67和CD34可能是声带白斑和癌前病变诊断的预测指标。Vash1在声带白斑和声带息肉在两组表达比较，差异无统计学意义，同时，在声带白斑组内，非异型增生和异型增生组间的表达比较，差异无统计学意义，在声带息肉组内两亚组间出现相同的结果，Vash1在声带白斑和癌前病变的诊断中可能无法起到明显的提示作用。相关性分析发现，Ki67和CD34的表达呈正相关(r=0.526，P=0.000)，Vash1和Ki67的表达也呈正相关，但二者之间的相关关系较弱(r=0.378，P=0.007)，Vash1和CD34的表达不相关(r=0.259，P=0.069)。在声带白斑癌变病例的分析中发现，Vash1和Ki67的表达两组间比较，差异有统计学意义(Vash1:P=0.019; Ki67:P=0.023)，CD34的表达在两组比较，差异无统计学意义(P=0.085)，可能与样本量过小有关。CD34-MVD值反映的是血管新生的能力，Vash1抑制微血管生成的作用由血管生成刺激因子(如VEGF等)诱导产生。因此可以推测，只有血管生成刺激因子的表达量升高到一定程度时，才会诱导Vash1的表达升高，因此也就可以认为在声带白斑组织中Vash1表达尚未出现明显升高，发展到喉癌才出现明显高表达。声带白斑复发病例的分析表明，Ki67和CD34在白斑复发的发生中起到重要作用， Ki67和CD34可能是声带白斑复发的预测指标。然而，本研究也存在局限性，研究中仅应用了免疫组织化学染色法，今后仍需要开展更大样本量、更长的随访时间以及核酸水平上的实验进行进一步验证。

综上所述，本研究认为Ki67和CD34在白斑发生、复发的过程中起重要作用，可能是预测声带白斑发生、癌前病变诊断、复发的重要标志物。Vash1和Ki67在声带白斑癌变的预测中可能也有重要作用。本研究为声带白斑及癌前病变的病理学诊断提供了理论支持，为预测其复发和癌变提供了潜在的生物学标志物，同时为进一步开展实验研究提供了研究基础。