β-AR信号通路介导去甲肾上腺素提高HT-29细胞侵袭能力的研究

赵 璐 倪依群 尤建良

慢性心理应激能促进恶性肿瘤的进展，在应激状态下，机体释放大量肾上腺素(epinephrine，E)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、皮质醇等激素至外周血中。其中，去甲肾上腺素作为一种经典的神经递质，能提高肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，通过β-肾上腺素能受体(β-adrenergic receptor，β-AR)信号通路使肿瘤的生物学行为和肿瘤所处的微环境发生改变[1～3]。一方面促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等物质的生成，提高肿瘤细胞迁移和侵袭能力，另一方面抑制机体的免疫反应，降低自然杀伤细胞(natural killer, NK)及T细胞等免疫细胞活性，最终促进肿瘤的进展。本研究旨在观察去甲肾上腺素通过β-AR信号通路对人结肠癌细胞株HT-29侵袭能力的影响及可能的作用机制。

材料与方法

1.主要材料与试剂：人结肠癌HT-29细胞株(ATCC)；McCoy′s 5A培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；去甲肾上腺素标准品、普萘洛尔标准品(美国Sigma公司)；CCK-8试剂盒(中国碧云天生物公司)；Matrigel基质胶、Transwell(8μm)小室(美国BD公司)；鼠抗人MMP-2(ab86607)、MMP-9(ab58803)、VEGF(ab69479)单克隆抗体(美国Abcam公司)；ERK1/2(4696)、p-ERK1/2(4370)单克隆抗体(美国CST公司)；反转录实时荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；PCR引物由华大基因合成，引物序列详见表1。

表1 引物序列

2.细胞培养：HT-29细胞用含10%胎牛血清的McCoy′s 5A培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养，0.25%胰酶常规消化传代。

3.细胞增殖能力检测实验：采用CCK-8法，收集对数生长期的细胞，以1.0×105个/毫升按每孔100μl 接种于96孔板，培养细胞融合至50%～60%，随机分为空白组和去甲肾上腺素组(0.1、1、10、100μmol/L)，每组设3个复孔。弃去培养基，空白组加入含10%血清培养基200μl，各去甲肾上腺素组加入含相应药物浓度的含10%血清培养基200μl。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下分别培养24及48h后加入CCK-8试剂20μl，继续避光培养2h。使用酶标仪于450nm波长处测定各孔吸光值，计算细胞存活率：存活率=(空白组平均A值-药物组平均A值)/空白组平均A值×100%。

4.Transwell侵袭实验：50mg/L Martigel基质胶以1∶8稀释包被Transwell小室上室面，4℃风干后吸弃小室中残余液体，每孔加入50μl含10g/L 牛血清白蛋白(BSA)的无血清培养基，37℃孵育30min。取对数生长期细胞，以无血清培养基饥饿12h后消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/ml，取200μl接种于包被及水化后的Transwell上室，分别加入无血清培养基、含0.1μmol/L去甲肾上腺素、1μmol/L去甲肾上腺素、10μmol/L去甲肾上腺素的McCoy′s 5A培养基。下室均加入500μl 含10%血清培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。48h后取出Transwell小室，用棉签擦去上室的细胞，PBS液冲洗3次，4%多聚甲醛固定15min，4g/L结晶紫溶液染色。显微镜下观察并计算穿膜细胞数。结果判定：200倍镜下计算5个视野的穿膜细胞数，取均值，并计算细胞的侵袭率。侵袭率=实验组细胞数/对照组细胞数×100%。

5.反转录实时定量PCR：药物干预48h后，TRIzol提取各组细胞中的总RNA，采用SYBR GreenERTMqPCR SuperMix Universal检测细胞中MMP-2、MMP-9和VEGF mRNA的表达情况，以GAPDH作为内参基因。采用SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR反转录试剂盒合成cDNA，反转录条件为：50℃ 30min，85℃ 5min，37℃ 20min，产物-20℃保存备用。以cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增条件为：50℃预变性2min，95℃变性10min，1个循环；95℃退火15s，60℃延伸60s，40个循环。根据参考文献，采用2-△△Ct法表示相对定量结果[4]。

6.蛋白印迹法：药物干预48h后，以蛋白裂解液裂解细胞并提取蛋白，采用考马斯亮蓝进行蛋白定量。蛋白经SDS-PAGE电泳后，转移至硝化纤维素膜(0.22μm，88024，美国Pierce公司)上，室温下脱色摇床上封闭1h。Anti-MMP2 鼠抗体(1∶500)、Anti-MMP9 鼠抗体(1∶500)、Anti-VEGF 鼠抗体(1∶200)，4℃孵育过夜，次日以兔抗小鼠 IgG(H+L)二抗(1∶5000，中国Beyotime公司)室温孵育2h。采用增强化学发光法(enhanced chemil-uminescene，ECL)进行显影。

结 果

1.不同浓度去甲肾上腺素对HT-29细胞增殖能力的影响：CCK-8增殖实验结果显示，随着培养时间的延长，细胞活力呈上升趋势。当分别加入0.1、1、10及100μmol/L去甲肾上腺素时，随着浓度增加先呈上升趋势，后又下降，同时100μmol/L去甲肾上腺素可明显抑制细胞生长，故选择10μmol/L去甲肾上腺素处理48h进行后期实验(图1)。

图1 不同浓度去甲肾上腺素对HT-29细胞增殖能力的影响A.对照组；B.0.1μmol/L去甲肾上腺素组；C.1μmol/L去甲肾上腺素组;D.10μmol/L去甲肾上腺素组；E.100μmol/L去甲肾上腺素组

2.去甲肾上腺素通过β-AR信号通路对细胞侵袭能力的影响：Transwell侵袭实验显示，随着去甲肾上腺素浓度的增加，HT-29细胞侵袭能力逐渐增强。与空白对照组比较，0.1、1、10μmol/L去甲肾上腺素组HT-29细胞迁移率分别为144.60%±0.58%、215.80%±29.15%、253.00%±16.78%，差异均有统计学意义(P<0.05)。同时将10nmol/L普萘洛尔作用于HT-29细胞。10nmol/L普萘洛尔组与对照组比较，差异无统计学意义。而10nmol/L普萘洛尔联合10μmol/L去甲肾上腺素组与10μmol/L去甲肾上腺素组比较，Transwell小室下层细胞数显著减少(P=0.016)，提示普萘洛尔可逆转NE对HT-29的促侵袭作用(图2)。

图2 不同药物处理组对HT-29细胞侵袭能力的影响(结晶紫，×200)A.对照组；B.0.1μmol/L去甲肾上腺素组；C.1μmol/L去甲肾上腺素组;D.10μmol/L去甲肾上腺素组；E.10nmol/L普萘洛尔组；F.10μmol/L去甲肾上腺素+ 10nmol/L普萘洛尔组;与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与10μmol/L去甲肾上腺素组比较，#P<0.05

3.去甲肾上腺素通过β-AR信号通路对HT-29细胞MMP-2、MMP-9、VEGF mRNA表达的影响：根据Transwell侵袭结果，将10μmol/L去甲肾上腺素作用于HT-29细胞24h后，通过qRT-PCR检测细胞MMP-2、MMP-9和VEGF mRNA表达水平。与对照组比较，10μmol/L去甲肾上腺能上调HT-29细胞中MMP-2(P=0.051)、MMP-9(P=0.002)和VEGF (P=0.026)mRNA表达水平，其中MMP-9和VEGF mRNA的表达比较，差异有统计学意义。而普萘洛尔联合去甲肾上腺素组与去甲肾上腺素组比较，MMP-2(P=0.041)、MMP-9(P=0.002)和VEGF(P=0.023)mRNA表达下调，差异有统计学意义(图3)。

图3 不同药物对HT-29细胞MMP-2、MMP-9和VEGF mRNA相对表达的影响A.对照组；B.10nmol/L普萘洛尔组；C.10μmol/L去甲肾上腺素组；D.10μmol/L去甲肾上腺素+10nmol/L普萘洛尔组；与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与10μmol/L去甲肾上腺素组比较，#P<0.05，##P<0.01

4.去甲肾上腺素通过β-AR信号通路对MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表达的影响：采用Western blot法检测去甲肾上腺素对MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表达的影响，与对照组比较，10μmol/L去甲肾上腺素作用HT-29细胞24h后MMP-2(P=0.033)、MMP-9(P=0.004)和VEGF(P=0.002)蛋白表达显著增加，差异有统计学意义。而10nmol/L普萘洛尔联合去甲肾上腺素组与去甲肾上腺素组比较，MMP-9(P=0.015)和VEGF(P=0.004)的蛋白表达减少，差异有统计学意义(图4)。

图4 不同药物对HT-29细胞MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表达的影响A.对照组；B.10nmol/L普萘洛尔组；C.10μmol/L去甲肾上腺素组；D.10μmol/L去甲肾上腺素+10nmol/L普萘洛尔组；与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与10μmol/L去甲肾上腺素组比较，#P<0.05，##P<0.01

5.去甲肾上腺素通过β-AR信号通路对HT-29细胞ERK1/2及其磷酸化蛋白表达的影响：采用Western blot法检测10μmol/L去甲肾上腺素对HT-29细胞ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达的影响。与对照组比较，普萘洛尔作用细胞24h后，ERK1/2和p-ERK1/2蛋白均无明显变化，而10μmol/L去甲肾上腺素组细胞p-ERK1/2蛋白表达明显增高(P=0.002)。将10nmol/L普萘洛尔与10μmol/L去甲肾上腺素共同作用于HT-29细胞后，p-ERK1/2蛋白表达较去甲肾上腺素组显著降低(P=0.012)，提示普萘洛尔可减弱NE对HT-29细胞ERK1/2活性影响的作用(图5)。

图5 不同药物对HT-29细胞ERK1/2和pERK1/2蛋白表达的影响A.对照组；B.10nmol/L普萘洛尔组；C.10μmol/L去甲肾上腺素组；D.10μmol/L去甲肾上腺素+10nmol/L普萘洛尔组;与对照组比较，*P<0.01；与10μmol/L去甲肾上腺素组比较，#P<0.05

讨 论

由于免疫系统对于调节实体肿瘤生长的不确定性，交感神经系统释放的应激激素能否直接影响到肿瘤细胞的增殖及转移潜能是近年来研究的热点。大量研究发现，在肿瘤进展和转移的各阶段中，机体应激状态下产生增多的神经肽及神经递质能够使肿瘤细胞的生物学行为发生改变[5]。人体交感神经节后纤维释放的神经递质主要为去甲肾上腺素，通过作用于α-AR和β-AR而发挥调控作用，研究表明，β-AR信号通路与肿瘤的发生、发展密切相关[6]。去甲肾上腺素与肿瘤细胞表面的β-AR结合，继而活化Ga蛋白介导的腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)，AC将三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)转化为环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，cAMP通过下游效应系统进一步调节细胞活动。由于肿瘤类型和肾上腺素能受体亚型的不同，应激激素在促进肿瘤细胞增殖的同时，也出现抑制的现象。如β-AR信号通路激活能促进乳腺癌细胞的增殖[7,8]。但采用吡布特罗激活β2-AR信号通路后，由于阻断了Raf-1/Mek-1/Erk1/2信号通路，则抑制了乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖，鉴于吡布特罗可以直接阻断Raf-1/Mek-1/Erk1/2信号通路，同时多数研究认为儿茶酚胺类抑制肿瘤增殖的机制大多是通过作用于细胞的α-AR或多巴胺转运蛋白[9,10]。因此，儿茶酚胺类物质对肿瘤细胞增殖的抑制作用是否通过β-AR信号通路实现目前仍存在争议。

研究发现，P物质、多巴胺及去甲肾上腺素能够提高乳腺癌细胞的迁移能力，其中去甲肾上腺素对乳腺癌细胞的移动具有趋化作用，并且能促进肺癌及前列腺癌细胞的迁移，而β-AR阻断剂能阻断这种促进作用[11～14]。本研究首先采用0、0.1、1、10μmol/L浓度的去甲肾上腺素作用于HT-29细胞，观察其对细胞体外侵袭能力的影响。随着去甲肾上腺素浓度的提高，HT-29细胞侵袭能力逐渐增强。根据既往研究提示，儿茶酚胺类物质对肿瘤细胞侵袭能力的促进作用主要是通过激活β-AR信号通路来实现的[6]。进一步采用非选择性β-AR阻断剂普萘洛尔对HT-29细胞进行预处理后再与去甲肾上腺素共同作用于HT-29细胞，观察细胞侵袭能力的变化。普萘洛尔能明显拮抗去甲肾上腺素对HT-29细胞体外侵袭能力的促进作用。

研究发现，儿茶酚胺类物质通过上调MMPs和VEGF的水平，提高口腔、前列腺、胰腺等恶性肿瘤细胞的血管生成及侵袭转移能力[15～17]。肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)作为一类具有降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)活性的酶家族，在肿瘤的浸润转移过程中起着关键的作用。其中，MMP-9作为家族中分子量最大的成员，通过降解ECM和基膜，使肿瘤细胞向周围组织浸润，同时通过促进新生血管的形成，从而加速肿瘤的侵袭转移。VEGF则是肿瘤新生血管形成的重要调控因子，在肿瘤的生长和转移过程中发挥重要的作用。研究发现，MMP-2和MMP-9能促进卵巢癌细胞株OVCAR3和SKOV3释放VEGF，提示VEGF和MMPs之间的相互作用可能在卵巢癌进展中发挥重要作用。此外，在研究人头颈部肿瘤细胞时发现，MMP-9与VEGF的水平呈正相关，并且与血管生成密切相关。在恶性胶质瘤细胞中同样观察到，VEGF水平与MT1-MMP、MMP-2和MMP-9均呈正相关。而MT1-MMP是激活MMP-2的重要组织因子，因此也提示MMPs具有调控VEGF的表达及生物学活性的作用。

随着研究深入，β-AR信号通路被发现在儿茶酚胺类物质促进肿瘤细胞侵袭转移的过程中扮演着桥梁作用[18,19]。本研究中qRT-PCR及Western blot法检测结果均证实，去甲肾上腺素作用于HT-29细胞48h后，MMP-2、MMP-9及VEGF的表达均有显著上调。将普萘洛尔阻断β-AR信号通路后能逆转去甲肾上腺素上调HT-29细胞MMP-9及VEGF 表达作用。本实验同时检测了去甲肾上腺素对ERK1/2信号通路的作用，结果发现去甲肾上腺素作用于HT-29细胞后，与对照组比较p-ERK1/2蛋白表达显著增高，而普萘洛尔能拮抗去甲肾上腺素的作用，减弱其对ERK1/2活性的影响。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)作为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成员之一，以非磷酸化和磷酸化两种形态存在于细胞中。其中，磷酸化ERK(phospho-ERK，p-ERK)在肿瘤侵袭转移过程中扮演重要的角色。p-ERK进入细胞核内，作用于核因子-κB、Ets、Sp1等转录因子，进而促进MMPs的转录与活化和肿瘤新生血管的形成，提高肿瘤细胞的增殖和侵袭能力[20,21]。本研究内容较为基础，后续将进一步通过动物实验或临床实验予以完善。

综上所述，本研究提示去甲肾上腺素通过β-AR信号通路，上调肿瘤转移相关因子的表达及ERK1/2的活性，进而提高HT-29细胞的体外侵袭能力。