微小RNA-20和线粒体融合蛋白1在子宫内膜癌中的表达情况及临床意义

王晓健，钟建明，刘小丹，曾庆芳

赣州市肿瘤医院门诊部，江西 赣州 341000

子宫内膜癌的发病率居中国女性生殖系统恶性肿瘤的第2位，严重威胁女性的生命健康[1]。目前子宫内膜癌的临床治疗效果并不理想，主要原因在于多数患者确诊时已处于中晚期，肿瘤细胞已发生转移。因此，临床上迫切需要寻找子宫内膜癌标志物，以便进行早期诊断和预后预测。研究显示，微小RNA（microRNA，miRNA）-20在肝癌、肺癌等多种肿瘤组织中均存在异常表达[2]。线粒体融合蛋白1（mitofusin 1，MFN1）是一种肿瘤相关蛋白，通过生物信息学软件预测发现，MFN1可能是miRNA-20的靶基因，因此推测miRNA-20可能通过影响MFN1基因表达，调控子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、侵袭及转移等生物学行为，但具体的作用机制还有待进一步分析[3]。本研究检测了子宫内膜癌组织中miRNA-20和MFN1的表达水平，并探讨了miRNA-20和MFN1表达情况与子宫内膜癌患者临床特征的关系，旨在为子宫内膜癌的早期诊断、高危人群筛选及治疗新靶点的寻找提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月至2019年1月于赣州市肿瘤医院接受手术治疗的子宫内膜癌患者。纳入标准：①经病理学检查确诊为子宫内膜癌；②接受手术治疗，且术前未行放化疗等抗肿瘤治疗；③临床资料和随访资料完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤。依据纳入和排除标准，本研究共纳入66例子宫内膜癌患者。同时选取60例接受子宫全切术的子宫肌瘤患者作为对照。子宫内膜癌患者的平均年龄为（52.10±8.29）岁；平均体重指数为（22.10±2.10）kg/m2；绝经37例，未绝经29例。子宫肌瘤患者的平均年龄为（50.38±9.11）岁；平均体重指数为（22.40±1.92）kg/m2；绝经35例，未绝经25例。子宫内膜癌患者和子宫肌瘤患者的年龄、体重指数、绝经情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。收集子宫内膜癌患者的子宫内膜癌组织66例和子宫肌瘤患者的正常子宫内膜组织60例。

1.2 实时荧光定量聚合酶链反应检测miRNA-20的相对表达量

取子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织标本进行研磨，加入1 ml Trizol试剂后经氯仿抽提，加入异丙醇沉淀后获得总RNA。采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）两步法将RNA逆转录为cDNA，然后进行扩增。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火和延伸20 s，循环40次。miRNA-20上游引物为5'-CAAATGCTCATAGTGCAGGTAG-3'，下游引物在逆转录试剂盒中；以β-actin为内参，上游引物为5'-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3'，下游引物为 5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。采用 2-△△Ct法计算 miRNA-20 的相对表达量[4]。

1.3 免疫组织化学染色法检测MFN1的表达情况

石蜡切片经梯度乙醇脱蜡及水化，蒸馏水冲洗，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗2次，每次3 min，然后进行抗原修复。为降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，采用H2O2室温孵育10 min，然后PBS冲洗3次。滴加适当比例稀释的羊抗兔MFN1抗体（1∶1000），37℃温箱中孵育30 min，4℃孵育过夜；滴加碱性磷酸酶标记的二抗后，37℃温箱中孵育30 min，PBS冲洗3次；1 ml二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）混匀后滴加到切片上，孵育10 min后显色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜下观察[5]。

1.4 随访发法

所有患者均采用门诊和电话等方式进行随访。术后2年内，每3个月随访1次，术后2～7年，每6个月随访1次，随访截止时间为2020年6月。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Cox比例风险回归模型进行多因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中miRNA-20和MFN1表达情况的比较

子宫内膜癌组织中miRNA-20的相对表达量为（0.65±0.12），明显低于正常子宫内膜组织的（1.03±0.17），差异有统计学意义（t=-14.597，P＜0.01）。子宫内膜癌组织中MFN1的阳性表达率为48.48%（32/66），明显低于正常子宫内膜组织的80.00%（48/60），差异有统计学意义（χ2=13.467，P＜0.01）。

2.2 不同临床特征子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中miRNA-20相对表达量的比较

不同年龄、体重指数、绝经情况、病理类型的子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中miRNA-20的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中miRNA-20的相对表达量分别明显低于FIGO分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

2.3 不同临床特征子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中MFN1阳性表达率的比较

不同年龄、体重指数、绝经情况、病理类型的子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中MFN1的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中MFN1的阳性表达率分别明显低于FIGO分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2）

表1 不同临床特征子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中miRNA-20相对表达量的比较（n=66）

表2 不同临床特征子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中MFN1阳性表达情况的比较（n=66）

2.4 预后因素分析

截至2020年6月，66例子宫内膜癌患者的生存率为81.82%（54/66），中位生存期为77个月。以子宫内膜癌患者的FIGO分期、淋巴结转移情况、miRNA-20相对表达量和MFN1表达情况作为自变量，以患者预后作为因变量进行Cox比例风险回归分析，结果显示，FIGO分期、淋巴结转移、miRNA-20相对表达量和MFN1表达情况均是子宫内膜癌患者预后的影响因素（P＜0.01）。（表3）

3 讨论

子宫内膜癌是发病率仅次于宫颈癌的妇科恶性肿瘤，近年来子宫内膜癌的发病率呈逐年上升且年轻化趋势。虽然子宫内膜癌的治疗技术与方法不断发展，但对于中晚期子宫内膜癌的治疗效果仍欠佳，特别是晚期和复发的子宫内膜癌患者，其治疗效果不理想[6-8]。因此，进一步探索子宫内膜癌中具有特异性和敏感性的分子标志物和治疗靶点是对子宫内膜癌进行早期诊断、改善治疗效果的关键。

miRNA可通过与靶基因3'端的完全或不完全互补结合而抑制目的基因的翻译及表达。相关研究已证实，miRNA在不同类型肿瘤中均可呈异常表达并参与个体发育、细胞分化、增殖、代谢、凋亡、迁移和侵袭等细胞生物学过程[9-11]。线粒体分解蛋白与线粒体融合蛋白的相对平衡是保证线粒体功能正常的基础，而线粒体功能可决定多种信号转导通路发挥作用。早期胚胎发育及卵母细胞成熟分裂的过程中，MFN1蛋白表达显著增加，囊胚期MFN1蛋白的表达量处于最高峰，进而参与卵母细胞的成熟分裂和组织的发育过程，这也提示MFN1与细胞的增殖、分裂具有密切联系[12-15]。

本研究结果显示，子宫内膜癌组织中miRNA-20的相对表达量和MFN1的阳性表达率均明显低于正常子宫内膜组织。超过半数的miRNA定位于或靠近染色体肿瘤区域，这些区域多存在基因缺失或异常扩增，能够调控多种重要的癌基因或抑癌基因，因此miRNA-20表达量下降可能影响相关信号通路，进而促进肿瘤的发生发展。MFN1蛋白表达水平的升高可增强线粒体融合功能，进而通过降低蛋白磷酸化水平和抑制胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2活化或周期蛋白的表达，从而抑制细胞生长，因此子宫内膜癌组织中MFN1蛋白表达水平下降可提示细胞异常生长，细胞异常增殖诱发癌变。

本研究结果还显示，FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中miRNA-20的相对表达量和MFN1的阳性表达率分别明显低于FIGO分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。该结果提示子宫内膜癌组织中miRNA-20及MFN1的表达水平越低，子宫内膜癌的发展越快。miRNA-20主要包裹在微小体、凋亡小体及其他外泌体中，能够在化学修饰作用下与血浆小分子物质形成蛋白复合体及囊泡，进入机体并被转运至受体细胞，再通过内吞、融合及结合受体等方式影响肿瘤的发生、发展。子宫内膜癌细胞生长需要线粒体不断裂变、聚变，生长过程需要消耗较多能量，而MFN2介导线粒体融合过程中重要蛋白质及内质网的应激反应，MFN1作为MFN2的替补蛋白，MFN2高表达时，MFN1低表达。

表3 子宫内膜癌患者预后影响因素的Cox比例风险回归分析（n=66）

本研究的多因素分析结果显示，FIGO分期、淋巴结转移、miRNA-20相对表达量和MFN1表达情况均是子宫内膜癌患者预后的影响因素（P＜0.01）。研究证实，miRNA-20能够调控抑癌基因的表达，从而影响细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、β-联蛋白（β-catenin）等细胞凋亡蛋白的表达，进而抑制细胞凋亡[16-18]。因此，miRNA-20可能通过影响细胞的正常凋亡影响子宫内膜癌的发生发展。MFN1具有细胞周期阻滞作用，可抑制细胞增殖和集落形成，削弱肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。因此MFN1低表达时，子宫内膜癌细胞异常增殖，从而促进了肿瘤的发生、发展。

综上所述，miRNA-20和MFN1在子宫内膜癌组织中呈低表达，且其表达情况与患者的临床特征和预后具有一定的关系。miRNA-20和MFN1有望成为子宫内膜癌早期诊断、恶性程度及转移潜能的重要预测指标，并有可能成为潜在的治疗靶点，具有广阔的临床应用前景，值得进一步研究。