叉头框蛋白C1和上皮钙黏素与胃癌患者临床特征和预后的关系及对细胞生物学行为的影响

郭新宇，田鹏，张鹏，刘毅，刘健康

河南省人民医院阜外华中心血管病医院普外科，郑州 450000

胃癌是发病率和病死率均较高的肿瘤之一，发病早期症状缺乏特异性，导致早期诊断率明显较低，但进展期胃癌患者的预后明显差于早期胃癌，因此，寻找影响胃癌预后的风险因素十分重要[1-2]。叉头框蛋白 C1（forkhead box C1，FOXC1）家族庞大且功能广泛，DNA结合区域有特殊的翼状螺旋结构是其结构特点，已有研究证实，FOX参与调控机体免疫、糖和脂类代谢、细胞周期和凋亡并保持胚胎干细胞的多功能性[3-4]。FOX家族成员之一的FOXC1被证实与肿瘤细胞的增殖、浸润转移密切相关，在多种肿瘤的发生发展中发挥作用[5]。上皮钙粘蛋白（E-cadherin）是钙依赖钙粘着素家族成员之一，主要分布于非神经细胞的上皮组织，主要功能是介导同种细胞间的黏附[6]。早期研究发现，E-cadherin黏附系统可明显抑制肿瘤转移，破坏多种恶性肿瘤的黏附功能，导致肿瘤细胞离散从而发生侵袭和远处转移[7]。目前，关于FOXC1和E-cadherin在胃癌临床预后中的相关性及对肿瘤细胞生物学行为的影响的报道较少，因此，本研究探讨FOXC1、E-cadherin在胃癌中的表达及与患者临床特征和预后的关系，并分析FOXC1、E-cadherin对胃癌细胞增殖、侵袭的影响及作用机制，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2013年3月至2014年3月在河南省人民医院胃肠外科一个病区手术治疗的97例胃癌患者。纳入标准：病理学诊断证实为胃癌；癌旁正常组织距离肿瘤边缘外2 cm以上且经病理学证实未发生癌变。排除标准：合并其他恶性肿瘤的患者；术前接受放化疗、免疫治疗或其他治疗。97例胃癌患者中男50例，女47例；年龄38～80岁，平均（55.16±10.43）岁；＜50岁41例，≥50岁56例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期64例；病理类型均为腺癌；分化程度：低分化65例；中分化21例，高分化11例；淋巴结转移74例，未转移23例；肿瘤直径：≥3 cm 69例，＜3 cm 28例；浸润深度：未及浆膜层24例，突破浆膜层73例。取97例胃癌患者的胃癌组织及相应的癌旁正常组织标本。本研究经本院伦理委员会批准通过，所有患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞和主要试剂 胃癌细胞系SGC7901和人永生化正常胃黏膜细胞系GES-1均购自中国科学院（上海）细胞库，干扰质粒pLVTHM-shFOXC1及阴性对照pLVTHM-shNC均由上海吉玛公司设计并完成，Anti-FOXC1抗体-ChIP Grade（山羊多克隆抗体 to FOXC1-ChIP Grade，ab5079）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的驴抗山羊IgG、Anti-E-cadherin抗体（兔多克隆抗体to E-cadherin，ab15148）、HRP标记的山羊抗兔IgG均购自美国Abcam公司，通用二步法检测试剂盒（PV9000）及二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒（ZLI-9018）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组化法检测FOXC1、E-cadherin的表达情况 取胃癌组织及相应癌旁正常组织样本固定包埋并切片，常规脱蜡和水化后，置于柠檬酸盐缓冲液中高压修复，采用3%双氧水室温下浸泡以阻断内源性过氧化物酶，封闭，分别加入稀释好的FOXC1、E-cadherin一抗4℃过夜孵育，次日复温后磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤干净，分别加入稀释好的HRP标记的驴抗山羊IgG、山羊抗兔IgG，室温孵育30 min，PBS洗涤。加入适量DAB孵育5 min，去离子水终止反应，苏木素复染，自来水冲洗后依次梯度乙醇脱水，二甲苯浸泡透明后干燥，中性树胶封片，镜检观察并记录实验结果。

结果判定：由两名经验丰富的病理医师对病理切片进行盲评。每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野随机计数200个细胞，以细胞出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达，依据染色强度及阳性细胞比例进行评分。染色强度计分：无着色计0分，淡黄色染色计分，棕黄色染色计2分，棕褐色染色计3分。阳性细胞所占比例计分：无阳性细胞计0分，＜25%计1分，25%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分。将染色强度和阳性细胞所占比例评分相加，≥3分为阳性，＜3分为阴性。

1.2.3 稳定干扰细胞系建立 将对数生长期的293FT细胞消化后加入含10%胎牛血清的高糖培养基，均匀铺至6孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞融合度达70%时换为无血清培养基继续培养。采用Lipofectamine 2000转染试剂并参照说明书，分别将干扰质粒pLVTHM-shFOXC1及阴性对照pLVTHM-shNC转染至293FT细胞，48 h后收获慢病毒液，分别感染备好的SGC7901细胞，48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP），将构建成功的稳定干扰细胞系分别记为SGC7901-shFOXC1和SGC7901-shNC，同时设置SGC7901空白对照。

1.2.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞中FOXC1、E-cadherin的相对表达量 分别提取空白对照SGC7901、人永生化正常胃黏膜细胞系GES-1、稳定干扰细胞系SGC7901-shFOXC1及阴性对照SGC7901-shNC的总蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒测定含量。加入上样缓冲液后煮沸以制备蛋白样品，取适量加入配制好的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶，电泳后转聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，加入含5%脱脂奶粉的封闭液室温下孵育2 h。分别加入适量用封闭液稀释的FOXC1、E-cadherin一抗，4℃冰箱过夜。次日复温后加入PBST洗膜，分别加入适量稀释好的HRP标记的驴抗山羊IgG、山羊抗兔IgG，室温震荡孵育2 h，PBST洗膜后加入电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）避光5 min，暗室曝光并拍照，同时以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）作为内参蛋白，计算FOXC1、E-cadherin的相对表达量。

1.2.5 平板克隆实验检测细胞增殖能力 将空白对照SGC7901、人永生化正常胃黏膜细胞系GES-1、稳定干扰细胞系SGC7901-shFOXC1及阴性对照SGC7901-shNC细胞消化后，接种于6孔板，每孔5×103，轻轻混匀后继续于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，隔周更换新鲜培养液，2周后用考马斯亮蓝染色，并在显微镜下计数菌落形成数量。重复实验3次，取平均数。

1.2.6 Transwell实验检测细胞侵袭能力 将基质胶Matrigel用无血清1640培养基以1∶5进行稀释，并取50 μl加入每个Transwell小室中，37℃静置待其凝固后使用。实验前12 h将细胞培养液换成无血清培养基，消化细胞后用灭菌PBS清洗并计数，加入无血清培养基重悬细胞使其密度为5×105/ml，取250 μl加入至Transwell小室中，下室中加入600 μl含10%胎牛血清的1640，并保证下室与Transwell小室间无气泡产生。37℃、5%CO2培养箱内培养24 h后弃掉Transwell小室中培养液，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定下室面，PBS洗涤后，室温下加入0.1%结晶紫染液避光染色15 min，用棉签将小室上层未迁移细胞轻轻擦掉，倒置晾干，置于倒置荧光显微镜下取5个高倍视野观察，并计数穿过基质胶的细胞数。重复实验3次取平均数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对所有数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或秩和检验；生存分析采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank检验；相关分析采用Spearman相关分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中FOXC1和E-cadherin表达情况的比较

胃癌组织中FOXC1蛋白的阳性表达率为74.23%（72/97），高于癌旁正常组织的42.27%（41/97），差异有统计学意义（χ2=20.039，P＜0.05）。胃癌组织中E-cadherin蛋白的阳性表达率为29.90%（29/97），低于癌旁正常组织的100%（97/97），差异有统计学意义（χ2=104.698，P＜0.05）。

2.2 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中FOXC1和E-cadherin表达情况的比较

不同性别、年龄胃癌患者胃癌组织中FOXC1、E-cadherin蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、分化程度为低中分化、淋巴结转移、肿瘤直径≥3 cm、基层浸润深度突破浆膜层胃癌患者胃癌组织中FOXC1蛋白阳性表达率较高、E-cadherin蛋白阳性表达率较低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

2.3 胃癌患者胃癌组织中FOXC1和E-cadherin表达的相关性

Spearman相关分析结果显示，胃癌患者胃癌组织中FOXC1表达与E-cadherin表达呈负相关（r=-0.645，P=0.000）。

2.4 预后情况的比较

以电话或定期门诊复查的方式对97例胃癌患者进行5年的随访，随访截止时间为2019年3月31日，总生存期（overall survival，OS）指从手术开始至患者死亡或随访结束的时间。结果显示，FOXC1阳性表达患者的5年生存率为56.94%，低于阴性患者的88.00%，差异有统计学意义（χ2=7.862，P＜0.05）；E-cadherin阳性表达患者的5年生存率为100%，高于阴性患者的50.00%，差异有统计学意义（χ2=22.325，P＜0.05）。FOXC1阴性 E-cadherin阳性患者5年生存率最高，为100%；其后依次为FOXC1和E-cadherin均阴性、FOXC1和E-cadherin均阳性，分别为80.00%、77.78%；FOXC1阳性E-cadherin阴性患者的5年生存率最低，为50.79%。

表1 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中FOXC1和E-cadherin表达情况的比较

2.5 不同细胞系中FOXC1和E-cadherin表达情况的比较

空白对照SGC7901、阴性对照SGC7901-shNC细胞中FOXC1蛋白的相对表达量均高于人永生化正常胃黏膜细胞系GES-1，E-cadherin蛋白的相对表达量均低于人永生化正常胃黏膜细胞系GES-1，差异均有统计学意义（P＜0.05）；稳定干扰细胞系SGC7901-shFOXC1中FOXC1蛋白的相对表达量低于空白对照SGC7901和阴性对照SGC7901-shNC，E-cadherin蛋白的相对表达量高于空白对照SGC7901和阴性对照SGC7901-shNC，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图1、表2）

图1 Western blot检测不同细胞系中FOXC1和E-cadherin的表达情况

2.6 FOXC1表达对胃癌细胞株SGC7901增殖能力的影响

平板克隆实验结果显示，稳定干扰细胞系SGC7901-shFOXC1细胞克隆数为（186±46），明显低于空白对照SGC7901的（895±204）和阴性对照SGC7901-shNC细胞的（884±226），差异均有统计学 意 义（t=7.581、6.767，P＜0.01）；空 白 对 照SGC7901和阴性对照SGC7901-shNC细胞克隆数比较，差异无统计学意义（t=0.081，P=0.937）。

表2 不同细胞系中FOXC1和E-cadherin蛋白的相对表达量（±s）

注：a与人永生化正常胃黏膜细胞系GES-1比较，P＜0.05；b与空白对照SGC7901比较，P＜0.05；c与阴性对照SGC7901-shNC比较，P＜0.05

细胞系FOXC1蛋白E-cadherin蛋白GES-1 SGC7901 SGC7901-shNC SGC7901-shFOXC1 F值P值0.09±0.031.68±0.32 0.67±0.15a0.18±0.09a 0.72±0.17a0.17±0.08a 0.24±0.08b c1.35±0.24b c 19.99342.409 0.0000.000

2.7 FOXC1表达对胃癌细胞株SGC7901侵袭能力的影响

Transwell实验结果显示，稳定干扰细胞系SGC7901-shFOXC1通过Matrigel基质胶的数量为（46±13），明显少于空白对照SGC7901的（176±57）和阴性对照SGC7901-shNC的（186±64），差异均有统计学意义（t=4.972、4.794，P＜0.01），空白对照SGC7901和阴性对照SGC7901-shNC通过Matrigel基质胶的数量比较，差异无统计学意义（t=0.261，P=0.800）。

3 讨论

转录因子是一类通过调控特定的靶基因，对细胞、组织及器官的生长发育、分化、代谢等生物学过程发挥作用的关键性蛋白。存在于低等生物至高等生物中具有广泛功能的FOX是一类庞大的转录因子家族成员，因其DNA结合区域存在特殊的翼状螺旋结构，即“叉头区”，因此，被称为叉头框转录因子。目前，已发现不同种属中从A～S等19个亚组共100多个FOX家族成员[8-9]。研究显示，作为叉头框转录因子家族成员之一，FOXC1参与了多种生物学过程，其基因遗传突变与胚胎发育异常密切相关[10-11]；此外，FOXC1还可促进卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤的进展，其过渡表达严重影响患者的预后[12-14]。本研究结果显示，FOXC1在胃癌组织中高表达，可能作为促癌分子参与了胃癌的发生发展过程。此外，TNM分期越高、分化程度为低中分化、淋巴结转移、肿瘤直径越大、组织浸润程度越深，FOXC1阳性表达率越高，表明FOXC1与肿瘤的恶性程度呈正相关，且促进了胃癌的侵袭和转移。

作为黏附分子家族成员之一，E-cadherin在钙离子参与下具有维持细胞间黏附连结、组织上皮完整性的作用，E-cadherin基因本身因具有跨膜结构特征而能参与细胞信号转导[15]。上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）参与多种实体肿瘤侵袭及转移的重要过程，其基本特征为E-cadherin基因缺失或表达下调，这主要是因为E-cadherin基因功能障碍可破坏肿瘤细胞间的黏附功能，从而使肿瘤细胞易于脱离原发灶并发生转移[16-17]。诸多肿瘤相关的研究结果显示，E-cadherin蛋白表达下调增强了恶性肿瘤的侵袭能力，使患者预后较差[18]。本研究发现，胃癌组织中E-cadherin蛋白的阳性表达率低于癌旁正常组织，表明E-cadherin在胃癌组织中呈低表达且发挥抑癌基因的作用。此外，TNM分期越晚、分化程度为低中分化、淋巴结转移、肿瘤直径越大、组织浸润越深，胃癌患者胃癌组织中E-cadherin的阳性表达率越低，表明E-cadherin与肿瘤的恶性程度呈负相关，且抑制胃癌的侵袭转移。

Spearman结果显示，胃癌患者胃癌组织中FOXC1表达与E-cadherin表达呈负相关（r=-0.645，P=0.000）。预后情况显示，FOXC1阳性表达患者的5年生存率低于阴性表达患者，E-cadherin阳性表达患者的5年生存率高于阴性表达患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。进一步证实FOXC1促进胃癌进展且不利于患者预后，E-cadherin则与FOXC1相反，抑制胃癌利于患者良好预后。

本研究成功构建了稳定干扰细胞FOXC1细胞系，以进一步研究FOXC1和E-cadherin在胃癌细胞中的相关性及其作用机制。结果显示，空白对照SGC7901、阴性对照SGC7901-shNC细胞中FOXC1蛋白的相对表达量均高于人永生化正常胃黏膜细胞系GES-1，E-cadherin蛋白的相对表达量均低于人永生化正常胃黏膜细胞系GES-1，差异均有统计学意义（P＜0.05），与组织检测结果相一致。SGC7901-shFOXC1细胞中，FOXC1基因被敲低而表达下调，表明稳转干扰细胞系构建成功，同时，E-cadherin表达上调，提示E-cadherin的表达能被FOXC1抑制，再次证实二者呈负相关性。研究显示，肿瘤的发生发展过程中，可能存在FOXC1基因表观遗传学的改变，FOXC1基因可能是通过调控细胞周期蛋白cyclin D1的表达影响细胞增殖[19-20]。本研究的平板克隆实验表明，敲低FOXC1的表达后，SGC7901细胞克隆数明显减少，说明FOXC1蛋白能促进胃癌细胞增殖。Transwell实验表明，敲低FOXC1的表达后，SGC7901细胞通过Matrigel基质胶的数量明显减少，说明FOXC1蛋白能增强胃癌细胞的侵袭能力。

综上所述，胃癌组织中FOXC1呈高表达，E-cadherin呈低表达，二者呈负相关；FOXC1通过促进胃癌细胞增殖、抑制E-cadherin表达来促进EMT进程，从而提高胃癌细胞的侵袭能力，最终导致胃癌的发生发展并影响患者的预后。