大白菜的化学成分研究

王 涵，司函瑞，焦玉凤，刘金平，李平亚

吉林大学药学院 吉林大学天然药物研究中心，长春 130021

大白菜(BrassicarapaL.ssp.pekinensis)为十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassicas)二年生草本植物，又名结球白菜、黄芽菜，原产于中国[1,2],最早历史记载始于西晋，古时称之为“菘”。大白菜中含有多种微量元素、维生素、无机盐、纤维素、蛋白质、氨基酸、糖苷、黄酮、生物碱、三萜皂苷、挥发油等成分[3,4]，民间有“百菜不如白菜”的说法，可见大白菜在居民蔬菜供应中占有重要地位。元代食疗专著《饮膳正要》记载其“通利肠胃，除胸中烦，解酒毒”。清代《本草纲目拾遗》记载：“白菜汁，甘温无毒，利肠胃，除胸烦，解酒渴，利大小便，和中止嗽”且“冬汁尤佳”。可缓解肺热、咳嗽、咽干、口渴、头痛、大便干结、丹毒、痔疮出血等病症[5,6]，是清凉降泻兼补益之良品，适合大部分人群食用。查阅文献发现，对大白菜的研究以栽培育种以及防虫害为主，对其化学成分的提取分离鲜有报道，为进一步明确大白菜中的化学成分，以期为其食用价值和药用价值提供参考依据，本课题组对吉林产大白菜的化学成分进行研究。

1 仪器与材料

大白菜于 2017年10月采购自吉林省长春市，由吉林大学药学院李平亚教授鉴定为十字花科芸薹属植物大白菜(BrassicarapaL.ssp.pekinensis)。

Xevo G2-XS QTOF四级杆飞行时间质谱仪(美国Waters公司);Acquity UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司);Acquity UPLC BEH C18色谱柱(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司);半制备高效液相色谱仪(Waters 1525二元 HPLC泵，Waters 2998二极管阵列检测器);SunFire Prep C18半制备色谱柱(10 mm×150 mm，10 μm，美国Waters公司);Bruker DRX 500、600核磁共振波谱仪(美国Bruker公司)；旋转蒸发仪(上海豫康科教仪器设备有限公司);DLSB低温冷却液循环泵(上海豫康科教仪器设备有限公司);Spectrumlab暗箱式紫外分析仪(上海棱光技术有限公司);FA1104N电子分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司);RCT-3200超纯水仪(长春博莱帕特科技发展有限公司);KQ-100数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);柱色谱硅胶(青岛鑫昶来硅胶有限公司);TLC硅胶板(青岛邦凯高新技术材料有限公司);反相C18硅胶(梯希爱上海化成工业发展有限公司);Sephadex LH-20(上海伊卡生物技术有限公司);乙腈(色谱纯，Fisher 公司);正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇(分析纯，北京化学工业集团有限责任公司);无水乙醇(工业级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司);甲醇、三氯甲烷、吡啶、二甲基亚砜(氘代试剂，上海思域化工科技有限公司)。

Hep-2 细胞株(中国科学院上海生命科学研究院);RPMI-1640 培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司);二甲亚砜(DMSO)、青霉素和链霉素(上海鼎国生物技术有限公司);MTT(美国 Sigma 公司)。MCO-20AIC CO2培养箱(中国Sanyo公司)。

2 实验方法

2.1 提取与分离

取新鲜白菜102 kg，剁碎，以5倍体积量的95%乙醇室温浸泡3次，第1次浸泡48 h，其余2次各浸泡24 h，合并3次浸泡所得提取液，过200目筛，所得滤液通过减压回收溶剂得到稠膏，将稠膏溶解于2 000 mL水中，依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，合并各部分萃取液，减压回收溶剂，干燥后得正己烷萃取物5.6 g，二氯甲烷萃取物12.2 g，乙酸乙酯萃取物 25.9 g，正丁醇萃取物260.2 g。

正己烷萃取物(5.6 g)经正相硅胶柱色谱，采用正己烷-乙酸乙酯系统(200∶1→0∶100)梯度洗脱，得到3个组分，其中Fr.1中结晶得到化合物1(5 mg)。

二氯甲烷萃取物(12.2 g)经正相硅胶柱色谱，采用正己烷-乙酸乙酯系统(200∶1→0∶100)梯度洗脱，得到5个组分，其中Fr.1中结晶得到化合物12(2mg).

乙酸乙酯萃取物(25.9 g)经正相硅胶柱色谱，以正己烷-乙酸乙酯系统(30∶1→0∶1)和氯仿甲醇系统(10∶1→1∶1)梯度洗脱，得到5个组分，其中Fr.2结晶得到化合物6(10 mg)，Fr.3经Sephadex LH-20和半制备液相以及重结晶得到化合物7(3 mg)，Fr.3经反复硅胶柱色谱和Sephadex LH-20得到化合物8(5 mg)。

正丁醇萃取物(124.2 g)经正相硅胶柱色谱，以氯仿甲醇系统(100∶1→1∶1)梯度洗脱，得到12个组分，Fr.1经正相硅胶柱色谱和反向硅胶柱色谱得到化合物2(7 mg)、14(5 mg)，Fr.2经正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱和半制备液相得到化合物10(2mg)、9(2 mg)、15(2 mg)，Fr.3经正相硅胶柱色谱和半制备液相得到化合物11(2 mg)，Fr.7经Sephadex LH-20和半制备液相得到化合物4(5 mg)、5(2 mg)，Fr.19经正相硅胶柱色谱和反向硅胶柱色谱得到化合物13(3 mg)，Fr.10经结晶和重结晶技术得到化合物3(512 mg)。

2.2 药理活性筛选

用MTT法检测该化合物对喉癌Hep-2细胞的抑制作用，将喉癌Hep-2细胞进行细胞计数后接种于96孔板内(体积为100 μL/孔，每孔细胞约1×105个/mL)，设相应浓度的溶媒对照孔及调零孔，然后加入不同浓度的药物，给药浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25 μM，每个浓度设6个复孔。药物与细胞共同孵育24 h后用MTT法检测细胞生长情况。吸尽培养基后，每孔加入90 μL无血清培养基，除空白孔外，每孔加入MTT 10 μL，置培养箱中反应4 h，吸尽培养基后，每孔加入100 μL DMSO混匀后充分吹打，使紫色结晶完全溶解后测定570 nm处的OD值。细胞增殖抑制率=[1-(用药组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

3 实验结果

3.1 结构鉴定

化合物1白色晶体(甲醇);10% 硫酸-乙醇溶液显紫红色，Liebermann-Burchard反应呈阳性，Molish反应呈阴性。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.38(1H，m，H-1)为烯氢信号，3.55(1H，m，H-3)为连氧氢信号，1.03(3H，s，19-CH3)，0.95(3H，d，J=1.0 Hz，21-CH3)，0.87(3H，m，26-CH3)，0.85(3H，m，29-CH3)，0.83(3H，m，27-CH3)，0.70(3H，m，18-CH3)为甲基上的氢信号。13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ：140.8(C-5)，121.7(C-6)，71.8(C-3)，56.8(C-14)，56.1(C-17)，50.1(C-9)，45.8(C-24)，42.3(C-4)，39.8(C-13)，37.3(C-12)，36.5(C-1)，36.2(C-10)，33.9(C-20)，33.7(C-7)，31.9(C-22)，31.7(C-8)，29.7(C-25)，29.2(C-16)，28.3(C-23)，26.1(C-2)，24.3(C-15)，23.1(C-28)，21.1(C-11)，19.8(C-27)，19.4(C-18)，19.0(C-29)，18.8(C-21)，11.9(C-26)，11.9(C-19)。以上数据与文献[7]报道基本一致，故鉴定化合物1为β-谷甾醇。

化合物2棕色油状物;常温下易溶于甲醇、醋酸乙酯、丙酮等。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：9.55(1H，s，H-5)，7.40(1H，d，J=3.6 Hz，H-2)，6.60(1H，d，J=3.6 Hz，H-3)，4.63(2H，s，H-6)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：179.4(CHO-)，163.2(C-5)，153.8(C-2)，124.7(C-3)，110.8(C-4)，57.6(CH2)。以上数据与文献[8]报道基本一致，故鉴定化合物2为5-羟甲基糠醛。

化合物3白色针状晶体;10% 硫酸-乙醇溶液显棕黄色，Molish反应呈阳性。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：3.83～3.54(7H，m，Fru-H)，3.42(2H，m，H-1)，1.47(2H，m，H-2)，1.31(2H，m，H-3)，0.84(3H，t，J=7.4 Hz，H-4)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：101.4(C-2′)，71.4(C-5′)，70.9(C-4′)，70.4(C-6′)，65.0(C-1′)，63.3(C-3′)，61.4(C-1)，33.1(C-2)，20.3(C-3)，14.1(C-4)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故鉴定化合物3鉴定为正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷。

化合物4透明胶状物;Molish反应呈阳性，1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：5.88(1H，d，J=15.6 Hz，H-7)，5.78(1H，s，H-4)，5.64(1H，dd，J=15.6，7.2 Hz，H-8)，4.44(1H，q，J=6.5 Hz，H-9)，4.18(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，3.76(1H，dd，J=11.9，2.0 Hz，H-6′ a)，3.55(1H，dd，J=11.9，6.2 Hz，H-6′b)，3.26～3.01(4H，m，H-3′，H-4′，H-2′，H-5″)，2.51(1H，d，J=17.0 Hz，H-2a)，2.09(1H，d，J=16.9 Hz，H-2b)，1.85(3H，s，H-13)，1.20(3H，d，J=6.5 Hz，H-10)，0.93(6H，d，J=12.7 Hz，H-11，12)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：199.9(C-3)，165.7(C-5)，132.3(C-7，8)，125.7(C-4)，99.8(C-1′)，78.6(C-6)，76.9(C-5′)，76.7(C-3′)，73.5(C-9)，73.2(C-2′)，70.2(C-4′)，61.4(C-6′)，49.3(C-2)，41.0(C-1)，23.3(C-12)，22.1(C-11)，20.9(C-10)，18.2(C-13)。以上数据与文献[10]报道基本一致，鉴定化合物4为(6S，9S)-长寿花糖苷。

化合物5白色粉末;1H NMR(800 MHz，CD3OD)δ：8.03(1H，d，J=8.1 Hz，H-6)，5.92(1H，d，J=4.7 Hz，H-1′)，5.71(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，4.18(2H，m，H-3′，H-2′)，4.02(1H，m，H-4′ )，3.86(1H，dd，J=12.5，2.7 Hz，H-5′b)，3.75(1H，dd，J=12.2，3.1 Hz，H-5′b)；13C NMR(201 MHz，CD3OD)δ：166.3(C-4)，152.2(C-2)，142.4(C-6)，102.3(C-5)，90.4(C-1′)，86.0(C-4′)，75.4(C-3′)，71.0(C-2′)，62.3(C-5′)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定化合物5为尿嘧啶核苷。

化合物6白色晶体;溴甲酚绿反应呈阳性。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：2.47(4H，s，-CH2)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：176.1(-COOH)，29.8(-CH2)。以上数据与文献[12]报道基本一致，故鉴定化合物6为琥珀酸。

化合物7白色粉末;1H NMR(800 MHz，CD3OD)δ：3.69(3H，s，-OCH3)，2.61(4H，s，H-2，H-3)；13C NMR(201 MHz，CD3OD)δ：176.1(-COOH)，174.8(COO-)，52.2(-OCH3)，29.9(C-2，3)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定化合物7为琥珀酸甲酯。

化合物8淡黄色粉末;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.33(1H，d，J=15.8 Hz，H-7)， 7.26(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，H-6)，6.65(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，H-5)，6.24(1H，d，J=15.7 Hz，H-8)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：177.3(C-9)，159.9(C-4)，142.2(C-7)，130.1(C-2，6)，128.2(C-1)，121.8(C-8)，116.4(C-3，5)。以上波谱数据和文献[14]对照一致，故鉴定化合物8为对羟基肉桂酸。

化合物9白色粉末;10% 硫酸-乙醇显色显黄色斑点，Molish反应呈阳性。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：4.29(1H，d，J=7.8 Hz)，1.25(3H，t，J=7.1 Hz，CH3)，3.97(1H，m)，3.68(1H，m)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：102.7(C-1′)，76.7(C-5′)，76.5(C-3′)，73.7(C-2′)，70.2(C-4′)，64.7(C-1)，61.3(C-6′)，14.0(C-2)。以上波谱数据和文献[15]对照一致，故鉴定化合物9为乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物10白色粉末;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：4.30(1H，dd，J=9.0，4.3 Hz，H-5)，4.19(2H，t，J=6.6 Hz，H-7)，2.58～2.46(1H，m，H-4a)，2.44～2.29(2H，m，H-3)，2.17(1H，m，H-4b)，1.74～1.63(2H，m，H-8)，1.43(2H，m，H-9)，0.98(3H，t，J=7.4 Hz，H-10)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：172.7(C-2)，64.9(C-7)，55.7(C-5)，30.3(C-8)，28.9(C-3)，24.5(C-4)，18.7(C-9)，12.6(C-10)。以上波谱数据和文献[16]对照一致，故鉴定化合物10为焦谷氨酸正丁酯。

化合物11白色粉末;碘熏显色，与三氯化铁试剂反应呈阳性，说明该化合物结构中含有酚羟基。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.90(2H，d，J=8.4 Hz，H-9，13)，6.61(2H，d，J=8.4 Hz，H-10，12)，4.14(1H，m，H-6)，3.56(1H，m，H-3)，3.10(1H，dd，J=13.9，3.5 Hz，H-7a)，2.74 (1H，dd，J=13.9，4.7 Hz，H-7b)，1.33(1H，m，H-15)，0.78(1H，m，H-14)，0.64(6H，m，H-16，17)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：170.6(C-2)，169.2(C-5)，158.1(C-11)，133.1(C-9，13)，127.2(C-8)，116.4(C-10，12)，57.7(C-6)，54.1(C-3)，45.2(C-14)，39.4(C-7)，24.8(C-15)，23.3(C-16)，21.3(C-17)。以上波谱数据和文献[17]对照一致，故鉴定化合物11为环(酪氨酸-亮氨酸)二肽。

化合物12白色粉末;碘熏显色。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：4.22～4.00(2H，m)，3.68(1H，m)，3.40(2H，m)，2.21(1H，m)，1.77～1.95(2H，m)，1.54(1H，m)，1.43(1H，m)，1.32(1H，m)，0.86(6H，m)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：171.4(C-4)，167.5(C-2)，58.8(C-3)，53.2(C-1)，45.0(C-7)，37.9(C-8)，27.6(C-5)，24.3(C-6)，22.2(C-9)，21.8(C-10)，20.8(C-11)。以上波谱数据和文献[18]对照一致，故鉴定化合物12为环(L-脯氨酸-D-亮氨酸)。

化合物13白色无定型粉末;1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：1.28(26H，s，13 × CH2)，0.90(3H，t，J=7.0 Hz，CH3)；13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ：33.0(C-3)，31.5(C-4)，29.3(C-4～13)，22.8(C-2)，22.3(C-15)，18.0(C-1)，13.7(C-16)。以上波谱数据和文献[19]对照一致，故鉴定化合物13为氯代正十六烷。

化合物14白色粉末;碘熏显色。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.35 (2H，t，J=4.8 Hz，H-9，10)，2.27～2.19 (2H，m，H-2)，2.01(2H，dd，J=12.6，6.7 Hz，H-8)，1.64(2H，dt，J=15.2，7.6 Hz，H-11)，1.30(22H，m，H-12～17，3～7)，0.88(3H，t，J=7.0 Hz，H-18)；13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ172.5(C-1)，129.9(C-9，10)，36.0(C-2)，31.9(C-16)，29.7(C-4，5)，29.7(C-6)，29.6(C-7)，29.5(C-8)，29.5(C-11)，29.4(C-12)，29.3(C-13)，29.2(C-14)，27.2(C-15)，25.5(C-3)，22.6(C-17)，14.1(C-18)。以上波谱数据和文献[20]对照基本一致，故鉴定化合物14为油酸酰胺。

化合物15白色粉末;碘熏显色。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：0.98(3H，s，H-19)，0.95(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.90～0.79(9H，m，H-29，26，27)，0.72(3H，s，H-18)；13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ：209.1(C-3)，209.0(C-6)，57.5(C-5)，56.6(C-14)，56.0(C-17)，53.5(C-9)，46.6(C-10，13)，45.8(C-7，24)，39.3(C-12)，38.1(C-1)，38.0(C-8)，37.4(C-2)，37.0(C-4)，36.0(C-20)，33.8(C-22)，29.7(C-25)，28.0(C-16)，26.0(C-23)，24.0(C-15)，23.0(C-28)，21.6(C-11，29)，19.8(C-26)，19.0(C-27)，18.7(C-21)，12.5(C-19)，12.0(C-18)。以上波谱数据和文献[21]对照基本一致，故鉴定化合物15为豆甾烷-3，6-二酮。

3.2 药理活性筛选结果

MTT法测得该化合物在给药浓度低于125 μM时，未表现出对喉癌Hep-2细胞明显的抑制作用，给药浓度为180 μM时对喉癌Hep-2细胞的抑制率达50%。

4 结论

本实验从十字花科芸薹属植物大白菜中共分离得到15个化合物，有11个首次从芸薹属植物中分得，14个首次从大白菜中分得，丰富了大白菜化学成分的参考资料。据报道，正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷(化合物3)具有诱导肝癌Bel-7402 细胞凋亡的作用,且随着浓度的升高和作用时间的延长，其诱导细胞凋亡作用增强，不同浓度的正丁基-β-D-吡喃果糖苷与Bel-7402细胞作用24、48 h可明显抑制Bel-7402 细胞存活，25 mg/L的正丁基-β-D-吡喃果糖苷抑制率达到42.39%[22]。因分离所得的化合物3含量达500 mg，在正丁醇层中大量存在，且已有活性研究基础，其余化合物因分离得到的数量少或未有文献报道显著活性，故只对化合物3进行了体外药理活性测试，结果表明给药浓度低于125 μM时，该化合物对喉癌Hep-2细胞的生长作用抑制不明显，为大白菜的生物活性研究提供了参考依据。