阿胶多肽的高分辨质谱鉴定及活性研究

熊雅茹，傅 红，杨 方

1福州大学生物科学与工程学院，福州 350108；2福州海关技术中心；3福建省检验检疫技术研究重点实验室，福州 350001；4福州大学 福建省海洋酶工程重点实验室，福州 350108

阿胶是我国具有免疫调节及改善营养性贫血功能的药食同源产品，为驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶[1]。性味甘平，具有补血、止血、滋阴润燥的功效，另可作肿瘤的辅助治疗。生物学的基础研究证明，蛋白质是人体新陈代谢中极为重要的营养物质，其降解产物生物活性肽及氨基酸更具广泛的生理调节功能[2,3]。多肽的活性与其氨基酸组成及排列密切相关。已有研究发现，疏水性氨基酸对多肽的生物活性起着关键的作用，N端连接Tyr、Phe等疏水性氨基酸时更有利于清除自由基[4]，而在抗凝肽C末端上添加疏水性氨基酸会增强抗凝效果[5]。

阿胶中蛋白含量约为60%～80%，主要由胶原蛋白、血清白蛋白等相对分子质量较大的蛋白质组成，不易被人体消化吸收。Fu[6]提出“阿胶的主要生物活性物质是阿胶含有的胶原蛋白经胃蛋白酶、胰蛋白酶降解后的能被机体吸收且有良好生物相容性的阿胶低肽”的工作假说，并对阿胶低肽制剂进行安全性检查、药效学研究及质量标准研究。Pang[7]研究发现阿胶经酶解后，相对分子质量减小且具有显著的补血升白作用。Zhang等[8]通过超高效液相色谱四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术鉴别鱼胶原蛋白粉的真伪。高分辨质谱联用技术是近年来用于研究蛋白质及多肽的有效方法，能直接对酶解产物进行准确快速的分析鉴定[9]。阿胶中的大分子物质经酶解后得到的多肽及氨基酸类物质可能对人体意义较大，本文在前人研究基础上，建立了采用UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术鉴定阿胶中肽的方法，并随机选择了鉴定的多肽进行抗氧化活性、抗凝血活性等功能试验，为印证阿胶功效提供技术手段与科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

DIONEX UltiMate 3000超高效液相色谱(美国Dionex公司)；四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(Q/Exactive)(美国Thermo Fisher Scientific公司)；全自动定氮仪(Kjeltec 8400 Analyzer Unit)；CR21N台式冷冻离心机(日立公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)；UV-2700紫外-可见分光度计(日本岛津仪器有限公司)。

阿胶(北京同仁堂)；胰蛋白酶(厦门泰京生物技术有限公司)；胃蛋白酶、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(血管紧张素转换酶，FAPGG)、凝血酶、纤维蛋白原(人)、血管紧张素转化酶(ACE)(美国Sigma-Aldrich公司)；卡托普利、抗坏血酸VC、过硫酸钾、邻二氮菲均为分析纯(国药集团)；法华林钠片(Orion Corporation)；ABTS、DPPH(上海麦克林生化科技有限公司)；Tris(生工生物工程股份有限公司)；乙腈、甲酸、甲醇均为色谱纯(Thermo Fisher公司)；三氯乙酸(分析纯，国药集团)；C18Tips(100 μL)(Thermo Scientific公司)；C18SPE固相萃取柱(500 mg/3 mL)(美国Supelco公司)。

1.2 实验条件

1.2.1 阿胶前处理

炖化：参考文献[7,10]，取过80目筛的阿胶粉1.5 g，加20倍量去离子水溶解，80 ℃炖化30 min，冷却至室温，冷藏过夜。4 ℃、18 000 rpm离心5 min，取上清液用脱脂棉抽滤，滤纸二次过滤，加去离子水补足30 mL，得阿胶炖化液。

酶解：阿胶炖化液30 mL置于小烧杯中，10% NaOH溶液调节pH=7.5，分别加入5x105U胰蛋白酶、复合胰蛋白酶-胃蛋白酶于40 ℃水浴酶解4 h后，沸水浴10 min灭酶活，4 ℃、18 000 rpm离心10 min，取上清液备用[11]。

净化：C18SPE柱依次用3 mL甲醇、3 mL去离子水活化，取酶解液3 mL过柱，用3 mL甲醇洗脱，重复3～4次，收集洗脱液，45 ℃氮吹至近干，用3 mL 1%甲酸溶液复溶，过0.45 μm滤膜[8]，上机待测。再用C18Tips柱处理酶解液作对照试验。

1.2.2 高效液相质谱试验条件

色谱条件：Hypersil GOLD UPLC C18色谱柱(2.1×100 mm，1.9 μm)；柱温：30 ℃；流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，洗脱梯度：0～50 min，乙腈10%→90%；50～55 min，乙腈90%；55～56 min，乙腈90%→10%；56～60 min，乙腈10%；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL。

质谱条件：扫描模式：Full MS/dd-MS2，分析时长60 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：100～1 500m/z，一级质谱分辨率：70 000 atm/z，AGG target：le6，一级Maximum IT：100 ms，Number of scan ranges：1，动态排除：40.0 s一次，MS2Activation Type：HCD，Isolation window：0.4m/z，二级质谱分辨率：17 500 atm/z200，Microscans：1，二级Maximum IT：50 ms，碰撞能量：30 eV，Underfill ratio：0.1%。电喷雾离子源：载气为高纯氮气(纯度>99.5%)，鞘气流速40个单位(arb)，辅气流速15个单位，吹扫气流速0个单位；喷雾电压3.2 kV；碰撞池采用梯度碰撞能量：25%、35%、55%；毛细管温度320 ℃，离子透镜电压频率为60，辅气热源温度350 ℃。

1.2.3 数据分析

采用MaxQuant(版1.6.1.0)进行数据分析。搜索针对包含来自Uniprot的阿胶(uniprot-donkey-hide gelatin.fasta)的蛋白质序列(https://www.uniprot.org，2018年11月3日下载)数据库。蛋白FDR设置为0.01；最小氨基酸长度设置为3；可变修饰设为N-Acetyl和Oxidation(M)；固定化修饰设置为Carbamidomethyl(C)；酶的设置分别选择非专一性和专一性，其中专一性酶设置为胰蛋白酶；最大裂解丢失设置为2，所有常见的污染物和相反的命中被删除[12]。

1.2.4 肽段抗氧化活性与抗凝血活性测定

多肽委托上海波泰生物技术有限公司合成，通过RPLC-MS检测其纯度为98%以上。ABTS自由基清除活性参考Wang[13]的方法进行测定，DPPH自由基清除活性参考Liu等[14]的方法进行测定，羟基自由基清除活性参考Xu15]的方法进行测定，抗凝血活性参考Wang[16]的方法进行测定。并用抗坏血酸VC、法华林钠片做阳性对照实验。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件优化

2.1.1 炖化

炖化和未炖化的阿胶经相同复合酶解过程，UPLC-Q-Exactive三次重复分析，炖化阿胶检测出多肽序列58条，其中有13条能找到对应生物种属，见表1；未炖化阿胶检测出多肽序列50条，有12条能匹配到对应蛋白种属。炖化阿胶与未炖化阿胶重叠检测到的多肽共29条，其中6条能匹配到对应种属，分别是QASSAVRDSGHR、ANKGFLEEVR、LSSPATLNSR、YEVEINRR、NHQLTVTRGSQK和YENELCLR。炖化阿胶共鉴定出了8种角蛋白、1种凝血酶原、1种纤溶酶原、1种凝胶溶蛋白。而未炖化阿共鉴定出了7种角蛋白、1种凝血酶原、1种纤维蛋白原。

阿胶中由于蛋白质比例占80%，故较难消化吸收，这正与中医上指出的阿胶“滋腻碍胃”相吻合[6]。对于消化功能差的病人，单纯的口服阿胶不仅不会达到应有的药效,反而会增重胃肠负担。本实验中炖化阿胶检测到更多序列，也从另一方面说明，生活中人们服用阿胶都是经过炖煮，高温使得阿胶中的蛋白进一步分解成氨基酸、多肽等易于消化吸收的小分子物质，从而发挥功效。因此后续优化阿胶酶解的实验中，均使用炖化后阿胶。

表1 炖化阿胶3次酶解活性肽段

2.1.2 酶解

人体消化过程关键酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶，本实验选用胰蛋白酶单独酶解、胰蛋白酶-胃蛋白酶复合酶解两种方式模拟消化过程对炖化阿胶进行酶解优化。结果表明，单独酶解效果优于复合酶解效果，胰蛋白酶单独酶解后3次重复分析共检测到了63条肽段，其中19条具有明确蛋白来源，如表2所示；而复合酶解检测到58条序列，12条具有明确蛋白来源。

经酶解优化后的检测结果明显更丰富，检测到了更多种类的蛋白，其活性也多种多样。如检测到的载脂蛋白具有胆固醇转运蛋白活性，参与脂蛋白代谢等生物过程；激肽原具有半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性的分子功能，参与炎症反应等生物过程。检测的阿胶多肽主要集中在6～25个氨基酸之间，最长的多肽是TTTIRQFTSSSSIKGSSGLGGGSSR，存在于Rattusnorvegicus、Pantroglodytes当中，参与各种皮肤附件的形成和维持，最短的肽段有TEELNR、AAPSRR、PGQSPR等。综合分析，胰蛋白酶单独酶解炖化阿胶效果更好。

表2 阿胶胰蛋白酶3次酶解活性肽段

2.2 净化条件选择

C18对非极性、弱极性以及中等极性化合物具有广泛的保留，采用C18SPE可以较好的保留胰蛋白酶酶切后的多肽，而将其他盐类物质脱除，适用于多肽质谱鉴定的前处理[17]。本文比较了C18Tips、C18SPE两种净化材料的效果，对比3次重复检测结果表明阿胶酶解产物经C18SPE处理后比C18Tips处理后多得到27条肽段，且多来源于酶原、角蛋白等，两种固相萃取柱的结果交叉匹配到5条序列，这可能是因为C18Tips过负载造成的，本文最终采用C18SPE净化。经优化试验后，液质联用分析阿胶炖化液酶解产物的总离子流图如图1所示。

2.4 阿胶多肽功能的筛选

阿胶具有补血、止血、改善钙代谢平衡、调节免疫功能、抗疲劳等药理作用[18]。动物类中药的有效成分以蛋白多肽为主，因此活性蛋白多肽具有重要的医疗保健价值[23]。近年研究表明，除营养功能外，蛋白质酶解产物中的一些短肽还具有广泛的生理调节功能，如促进钙吸收、降血压、降低胆固醉、免疫调节等。以胶原的适度降解产物为原料，通过不同种类的酶和催化方式，可制备具高抗氧化性的胶原肽[19]；Yao等[20]研究发现阿胶对休克时血液粘滞性的增加有明显抑制作用，一定程度维持了有效循环血量，利于微循环恢复正常。

图1 阿胶胰蛋白酶酶解产物的总离子流谱图Fig.1 Total ion flow spectrogram of trypticase of donkey-hide gelatin

有研究报道，疏水性氨基酸对多肽的抗氧化性起着关键作用，疏水性氨基酸含量越高，其抗氧化能力越强[14]。目前一些肽类化合物已被发现具有显著的抗凝血活性，部分活性肽的结构也得到进一步的鉴定。有研究实验表明多肽C末端上的氨基酸疏水性越强，其抗凝血效果越好[5]。

UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱连用仪分析，将本实验所得肽段在UniProt上进行BLAST序列对比，挑选C端具有强疏水性氨基酸如Leu(L)、Phe(F)、Tyr(Y)或参与纤维蛋白溶解等生物过程的肽段做体外抗凝血活性实验，挑选N末端具有疏水性氨基酸或序列中疏水氨基酸比例较高的肽段做体外抗氧化活性实验[21]。从三次重复检测结果中筛选并验证9条肽段活性，结果如下表3所示。

表3 肽段序列分析

2.5 阿胶多肽的体外活性实验

2.5.1 ABTS自由基清除活性

由图2可知，9条肽段均具有ABTS自由基清除活性。在0.5～2.5 mg/mL范围内，多肽浓度升高，清除作用渐强。ABTS自由基清除能力从大到小依次是YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、LYEEEIR、LASYLDK、MDNPDTFYSLKYQIK、ANKGFLEEVR、QHASQVLIRR、FAAFIDK、IAVGGFR。其中多肽YQCLKGTGK的ABTS自由基清除力最高，2.5 mg/mL时为82.41%±0.41%，0.5 mg/mL时清除率已经远大于50%。

2.5.2 DPPH自由基清除活性

由结果可知，9条肽段均具有DPPH自由基清除活性，在0.5～2.5 mg/mL范围内呈现良好线性关系。当多肽溶液浓度为2.5 mg/mL 时，DPPH自由基清除能力从大到小依次是YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、QHASQVLIRR、IAVGGFR、LASYLDK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR、LYEEEIR。其中多肽YQCLKGTGK的DPPH自由基清除力最高，2.5 mg/mL时为64.74%±0.36%，半抑制浓度(IC50值)远小于0.5 mg/mL，详细结果见图3。

图2 多肽及阳性对照组对ABTS自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of peptides and positive control group to ABTS free radicals

图3 多肽及阳性对照组对DPPH自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of peptides and positive control group to DPPH free radicals

2.5.3 羟基自由基清除活性

结果显示，5条多肽表现出羟基自由基清除活性，且随浓度升高，清除作用越强。浓度为2.5 mg/mL时，羟基自由基清除能力从大到小依次是YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR。多肽YQCLKGTGK的半抑制浓度(IC50值)远小于0.5 mg/mL，2.5 mg/mL时羟基自由基清除率高达95.62%±0.20%。未表现出羟基自由基清除活性的肽段有QHASQVLIRR、IAVGGFR、LASYLDK和LYEEEIR，具体结果见图4。

图4 多肽及阳性对照组对羟基自由基的清除能力Fig.4 Scavenging ability of peptides and positive control group to hydroxyl free radicals

2.5.4 抗凝血活性

结果表明，5条多肽表现出抗凝血活性，随着浓度升高，对凝血酶抑制活性越强。浓度为2.5 mg/mL时，抗凝血活性从大到小依次是MDNPDTFYSLKYQIK、QHASQVLIRR、LYEEEIR、LASYLDK、CTTPPPSSGPKYQCLK，见图5。多肽MDNPDTFYSLKYQIK的半抑制浓度(IC50值)约为1.9 mg/mL，2.5 mg/mL时抗凝血活性高达80.78%±0.22%。未表现出抗凝血活性活性的肽段有YQCLKGTGK、ANKGFLEEVR、FAAFIDK和IAVGGFR。

图5 多肽及阳性对照组的抗凝血活性Fig.5 Anticoagulant activity of peptides and positive control group

2.6 多肽活性与结构分析

选出的9条多肽都具有一定强度的抗氧化活性，对比阳性对照组的L-抗坏血酸结果，抗氧化能力较强的序列为YQCLKGTGK和CTTPPPSSGPKYQCLK。肽段CTTPPPSSGPKYQCLK的C末端是脂肪族氨基酸Leu(L)、碱性氨基酸Lys(K)，序列中含有大量的疏水性氨基酸Pro(P)、Lys(K)、Tyr(Y)。肽段YQCLKGTGK 的N末端是芳香族氨基酸酪氨酸Try(Y)，C末端是碱性氨基酸Lys(K)，序列中含有疏水性氨基酸Leu(L)、Lys(K)，且对3类自由基清除能力最强。IAVGGFR、LASYLDK、LYEEEIR的N末端是疏水性氨基酸亮氨酸Leu(L)，且疏水性氨基酸含量均达到40.00%以上，表明多肽的抗氧化活性与N末端氨基酸的组成以及多肽链疏水氨基酸的占比有一定联系[22]。将抗氧化活性最强的多肽YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK在Uniprot上进行蛋白质 Blast，所得结果见图6，该多肽存在于Plasminogen第281、289、268～284位，其生物详细信息见表4。

表4 肽段MaxQuant分析结果

结果显示，具有抗凝血活性的5条多肽分别是MDNPDTFYSLKYQIK、QHASQVLIRR、LYEEEIR、LASYLDK和CTTPPPSSGPKYQCLK。这可能和其C端均连接了2个或以上数量的疏水氨基酸有关，此前有研究实验表明在抗凝肽的C-端添加上疏水性越强的氨基酸，其抗凝血效果得到显著提高[5]，且MDNPDTFYSLKYQIK、LYEEEIR、LASYLDK和CTTPPPSSGPKYQCLK 4条多肽中疏水氨基酸占比均40%以上，对比阳性对照组得到的结果相一致。在UniProt中对这两条肽段进行BLAST搜索，可知MDNPDTFYSLKYQIK具有内肽酶活性负调节等功能，QHASQVLIRR具有刺激纤维蛋白溶解等功能。

图6 Plasminogen氨基酸排列图Fig.6 Amino acid alignment of plasminogen

3 结论

本文用酶解阿胶炖化液联合UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用仪分析的方式，研究阿胶中多肽结构与其对应生物活性的关系。3次重复质谱鉴定，检测出63条多肽，其中有19条明确生物来源，分子功能与生物活性呈多样性。根据分析结果与多肽活性构效关系，挑选出9条阿胶多肽进行体外活性测定，结果显示9条多肽均具有抗氧化活性，5条序列具有抗凝血活性。多肽的抗氧化、抗凝血活性是多种因素共同作用的结果，其中末端氨基酸的种类，肽链中氨基酸的组成以及肽链长度对肽段活性均有一定的影响，这一结果为揭示阿胶多肽结构与功能的关系奠定基础。