基于HPLC-Q-TOF-MS和HS-SPME-GC-MS法分析龙牙百合中的化合物

赵康宏，周 峰，严思恩，刘东波，谢红旗,3*

1湖南农业大学园艺学院；2国家中医药管理局亚健康干预技术实验室；3中兽药湖南省重点实验室，长沙410128

百合是一种药食同源中药材[1]，除了富含多种营养成分外，还含有多种活性成分，如：皂苷、多糖、酚酸、生物碱等，因此，百合也具有广泛的药理活性，如抗炎、抗氧化、调节血糖、增强免疫力等[2]。此外，百合中还含有一些挥发性成分，但目前研究报道多集中在对其花、叶中的挥发性成分进行定性、定量分析[3]，对鳞茎中挥发性成分的研究鲜有报道。

通过文献查阅，发现目前关于兰州百合、卷丹百合等品种的研究报道较多，关于龙牙百合(LiliumbrowniiF.E.Brown var.viridulumBaker)干样中甾体皂苷[4]、酚酸甘油酯、多糖及生物碱等化学成分[5]的研究报道也不少，但关于新鲜龙牙百合化学成分的研究报道则较少。重要的是，龙牙百合是一种传统中药材，收录于《中国药典(2015版)》，药典中著述了其具有养阴润肺，清心安神的功效，且用于阴虚燥咳，劳嗽咳血，虛烦惊悸,失眠多梦，精神恍惚等病症[6]，但是对其质量标准仅以浸出物含量来评价，对化学成分方面并无明确的要求。因此，本文从化学成分分析的角度，采用HPLC-Q-TOF-MS法和HS-SPME-GC-MS法对龙牙百合中的化学成分进行分析，探索龙牙百合的次生代谢产物的种类，旨在为龙牙百合药效物质基础的深入研究和资源的合理开发利用提供帮助。

1 材料与仪器

1.1 材料

样品由湖南省绿远农业发展有限公司(Hunan Lvyuan Agricultural Development Co.,Ltd.)提供(2019年6月28日)，并经湖南农业大学园艺学院曾建国教授鉴定为龙牙百合(百合LiliumbrowniiF.E.Brown var.viridulumBaker.)。

鲜样为2019年6月28日提供，同批次样品经该公司进行干燥后提供。干燥工艺简述为：鲜百合经剥片、漂洗、杀青、热风循环干燥等工序制得干样。

1.2 试药

乙腈为色谱纯(德国Merk公司)；乙醇、甲酸(分析纯，国药集团(上海)化学试剂有限公司)；王百合苷B(1-O-p-coumaroyl-2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-acetylglycerol)(分析标准品，纯度≥98%，CAS：114420-67-6，上海源叶生物技术有限公司)；去离子水由超纯水仪(四川优普超纯科技有限公司)制得。

1.3 仪器

XS250分析天平(METTLER TOLEDO，USA)；1260高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF-MS)(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)；2010气相色谱-质谱联用仪(GC-MS-QP)(Shimadzu Co.,Ltd.,Japan)；聚二甲基硅烷萃取头-65 μm(Supelco Co.,Ltd.,USA)。

2 方法

2.1 HS-SPME-GC-MS法分析挥发性成分

2.1.1 顶空固相微萃取条件

精密称取低温(45 ℃)干燥后的龙牙百合样品200±0.5 mg，置于15 mL顶空瓶中，并将其置于磁力搅拌器平面上插入装有萃取头的手动进样器，70 ℃下预热40 min，再将萃取头伸出顶空萃取40 min，取出后立即插入色谱仪240 ℃进样口，解吸5 min。

2.1.2 色谱条件

采用CD-WAX(30 m×25 mm，0.25 μm)色谱柱，载气为氦气，流速：1.00 mL/min，柱温箱温度：50 ℃，进样口温度：240 ℃，温度程序：起始温度50 ℃保持4 min，6 ℃/min的速度升至200 ℃并保持10 min，8 ℃/min的速度升至240 ℃并保持15 min。

2.1.3 质谱条件

采用EI离子源，离子源温度：200 ℃，接口温度：220 ℃，扫描模式：全扫描，扫描时间：3～57 min，扫描范围：m/z45～500。

2.2 HPLC-Q-TOF-MS法分析

2.2.1 供试品溶液的制备

称取5.0±0.05 g龙牙百合样品于磨口锥形瓶，加入100 mL 80%乙醇溶液，于40 ℃下超声提取30 min，冷却至室温后于4 ℃，8 000 rpm下离心20 min，将上清液过0.22 μm有机滤膜后即为供试品溶液。

2.2.2 标准溶液的配制

精密称取王百合苷B标准品1.64±0.01 mg于10 mL棕色容量瓶，用80%乙醇溶液定容后即得母液。进样前用80%乙醇溶液将母液逐级稀释至16.4、32.8、49.2、65.6、82.0 μg/mL，过0.22 μm有机膜后进入色谱系统分析。

2.2.3 色谱条件

采用安捷伦1260色谱系统，Agilent-ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，DAD检测器，以A相0.1%甲酸水，B相乙腈作为流动系统，采用梯度洗脱：B相(%)0～5 min为10%→12%，5～20 min为12%→15%，20～25 min为15%→19%，25～40 min为19%→30%，40～50 min为30%→40%，50～55 min为40%→35%，55～56 min为35%→10%，56～60 min为10%。检测波长λ=315 nm，柱温35 ℃，进样量20 μL，流速0.7 mL/min。

2.2.4 质谱条件

基于安捷伦6350 Q-TOF-MS质谱系统，通过优化质谱条件，采用负离子模式电喷雾离子源(ESI-)，TOF质量扫描范围：m/z100～1 700；载气温度300 ℃，流速8 L/min；雾化压力35 psig；鞘气温度350 ℃，流速11 L/min；毛细管电压3 500 V；碰撞诱导解离电压175 V,设置能量梯度为15～25 V 3个梯度。

2.3 数据处理

采用Origin 2018进行数据处理及绘图；数据结果均表示为平均值±标准偏差(SD)；采用ChemDraw 15.0进行化学结构绘制。

3 结果与分析

3.1 GC-MS结果与分析

龙牙百合采用固相顶空微萃取技术进行挥发油的提取，并通过GC-MS进行定性、定量分析，鲜百合和干百合样品的谱图分别见图1和图2。通过检索NIST数据库对各挥发性成分进行定性分析，采用面积归一化法进行定量分析，求得各化学成分在挥发油中的相对百分含量。如表1所示，从鲜百合中共分离并鉴定了37种挥发性成分，分别是醛、酸、烷、醇、酯五类化合物。其中，相对含量达1%以上的有17种，含量最高的为正己醇(25.87%)和正己醛(18.80%)，正己醇和正己醛是食用香精和香料原料，可能正是百合清香味来源的物质基础。如表2所示，从干百合中共分离并鉴定了22种挥发性成分，主要是醛、酸、醇、酯四类化合物，成分种类相比鲜百合少15种。其中，相对含量达1%以上的有15种，含量最高的为正己醛(36.76%)、正己酸(13.80%)、乙酸(13.20%)、正戊酸(7.45%)。

图1 龙牙百合鲜样GC-MS总离子流图(TIC)Fig.1 GC-MS total ion chromatogram (TIC) of fresh Longya lily

图2 龙牙百合干样GC-MS总离子流图(TIC)Fig.2 GC-MS total ion chromatogram (TIC) of dry Longya lily

表1 龙牙百合鲜样通过GC-MS鉴定的37个挥发性成分

续表1(Continued Tab.1)

结果表明，龙牙百合干样和鲜样中的共有组分为11种，均是正己醛含量相对较高，但干样中正己醇含量相对较低(5.98%)，约为鲜样的40%，乙偶姻(3-羟基2-丁酮，一种重要的食用香料)的含量在在鲜样中达7.25%，而在干样中含量大大降低，仅为0.30%，，相差24倍。正己酸的含量在鲜样中占3.59%，但在干样中达13.80%。

3.2 LC-MS结果与分析

3.2.1 线性关系考察

在色谱条件下，通过王百合苷B的进样量(μg/mL)对峰面积进行回归，得到标准曲线方程为：y= 10.277x+ 25.757；R2=0.999 7。该工作曲线的相关系数R2>0.998 5，表明进样量在16.4～82.0 μg/mL范围内，王百合苷B的进样量与峰面积呈现良好的线性关系。

3.2.2 HPLC结果与分析

HPLC图谱表明(如图3所示)，在λ=315 nm下，各个化合物分离度较高(仅有个别化合物未达到基线分离)，无拖尾现象。从新鲜龙牙百合鳞片中共检测到12个化合物，以王百合苷B当量计(如表3)，1-O-p-coumaroyl-3-O-β-D-glucopyranosylglycerol、1-O-caffeoyl-3-O-p-coumaroylglycerol、1-O-p-coumaroyl-2-O-hydroxymethy-3-O-acetylglycerol、1-O-p-coumaroyl-2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-acetylglycerol等4个化合物的相对含量较大，均达900 μg/g以上；从干样中共检测到5个化合物，以王百合苷B当量计(如表4)，1-O-caffeoyl-3-O-p-coumaroylglycerol和1-O-p-coumaroyl-2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-acetylglycerol两个化合物的相对含量较高，达5 122.68和2 897.03 μg/g，含量约为鲜百合中的30%，尤其是1-O-p-coumaroyl-2-O-hydroxymethy-3-O-acetylglycerol的含量在鲜样中达4 437.30 μg/g，但在干样中仅100.42 μg/g，含量相差约44倍。

表2 龙牙百合干样通过GC-MS鉴定的22个挥发性成分

3.2.3 MS结果与分析

采用HPLC-Q-TOF-MS在负离子模式下进行一级、二级质谱扫描，通过精确分子量、二级质谱离子碎片信息与文献及Chemspider数据库比对，结果表明(见图4和表3)，在负离子模式下，鲜百合中共检测出19个化合物。各化合物结构推测及命名如下，结构式如图5和图6所示。

化合物1[M-H]-=232.121 7，与He等[7]报道的Cyclocostunolidez相似，由于本试验中HPLC-DAD的检测波长λ=315 nm，但木脂素类化合物常用检测波长λ=217 nm，因此在HPLC图谱中未见响应。

化合物2[M-H]-=415.125 5，有两个丰度较大的离子碎片：[A1-H]-=179.035 2和[A2-H]-=163.042 3；[A1-H]-为咖啡酸m/z180.14失去一个H，[A1-COOH·]-=135.045 9是咖啡酸脱去一个羧基形成，[A2-H]-是香豆素酸m/z164.16失去一个H，[A2-COOH·]-=119.102 2是香豆素酸发生了脱羧反应，根据文献[8,9]，推测分子式为C21H20O9，命名为1-O-caffeoyl-3-O-β-D-glucopyranosylglycerol。

图3 龙牙百合干样和鲜样的HPLC色谱图Fig.3 The HPLC chromatogram of dry and fresh Longya lily注：*王百合苷B。Note:*Regaloside B.

化合物3～5准分子离子峰均为m/z399，且MS/MS碎片信息接近，其中，[A-H]-=163可能是香豆素酸脱H或[A-OH·]-=163是葡萄糖脱羟基。因此，结合文献报道[8,9]和检索Chemspider数据库，推测该三个化合物的分子式为C18H24O10，分别命名为 1-O-p-coumaroyl-3-O-β-D-glucopyranosylglycerol；1-O-caffeoyl-3-O-p-coumaroylglycerol；1-O-caffeoyl-2-O-p-coumaroylglycerol。

化合物6[M-H]-=429.140 8，[A1-H]-=193.051 7是阿魏酸m/z194.19在负离子模式下脱去一个H，[A1-H-COOH·]-=134.038 6是阿魏酸发生了脱羧反应，[M-Glu+OH·]-=267.090 5是母核上脱去一分子葡萄糖，且葡萄糖与母核相连的O留在了母核上。根据文献报道[10]，推测分子式为C18H26O11，命名为1-O-feruloyl-2-O-β-D-glucopyranosylglycerol。

化合物7[M-H]-=457.135 9，[A1-H]-=179.036 0是咖啡酸m/z180.15脱去1个H，[A1-COOH·]-= 135.044 6是咖啡酸发生了脱羧反应，[Glu-H2O]-=162.024 8是葡萄糖m/z180.16脱去一分子H2O，结合文献报道[9]，推测其分子式为C20H26O12，命名为1-O-acetylcaffeoyl-3-O-β-D-glucopyranosylylycerol。

化合物8[M-H]-=309.062 5，[A1-H]-=163.041 0是香豆素酸脱去1个H，[Gly-2OH·+Ace]-= 101.025 9是甘油上被乙酰化且脱去了两个羟基，[M-H-A1]-= 145.015 1是母核上脱去一个香豆素酸，[Gly-3H+CH2OH·]-= 127.004 5是甘油上接了一分子羟甲基。文献中未见报道，仅根据本文其他酚酸类化合物的质谱裂解特征，推测分子式为C15H18O7，命名为1-O-p-coumaroyl-2-hydroxymethoxy group-3-O-acetylglycerol。

化合物9[M-H]-=441.144 1，[A1-H]-=163.040 8是香豆素酸脱去1个H，[A1-COOH·]-= 119.050 7是香豆素酸发生了脱羧反应， [M-Ace-OH·]-= 381.120 6是母核上发生了去乙酰化反应，[M-Glu-Ace]-= 219.066 6是母核上脱去一分子葡萄糖和一个乙酰基。结合文献报道[9]，推测分子式为C20H26O11，命名为1-O-p-coumaroyl-2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-acetylglycerol。

化合物15[M-H]-=429.119 5，[A1-COOH-OH]-=134.038 0是阿魏酸发生了脱羧反应，[A1-H]-= 193.051 6是阿魏酸脱去1个H， [M-A1-H]-= 235.062 3是母核上脱去一分子阿魏酸，[M-Glu+OH·]-= 267.091 4是母核上脱去一分子葡萄糖，且葡萄糖与母核相连的O留在了母核上。根据文献报道[10]，推测分子式为C19H26O11，命名为1-O-feruloyl-3-O-β-D-glucopyranosylglycerol。

化合物16[M-H]-=383.114 6，[A1-COOH·]-=119.050 9是香豆素发生了脱羧反应，[M-2(4-ethenylphenol)+H]-=145.033 5是母核上同时脱下两分子4-乙烯基苯酚，[A1-H]-=163.040 8是香豆素酸丢失1个H， [M-A1-H]-=219.063 3是母核上脱去1分子香豆素酸，结合文献[15]，推测其分子式为C21H20O7，命名为1,3-O-di-p-coumaroylglycerol。

化合物17[M-H]-=413.124 9，[A1-COOH·]-=119.052 4是是香豆素酸发生了脱羧反应，[A1-H]-=163.041 4是香豆素酸丢失1个H，[A2-H]-=193.051 8是阿魏酸脱去1个H，[A2-OH·]-=177.055 9是阿魏酸脱去1个羟基， [M-A1-H]-=235.061 9是母核上脱去一分子香豆素酸，[M-A2-H]-=219.066 5是母核上脱去1分子阿魏酸。根据文献[15]，推测分子式为C22H22O8，命名为1-O-feruloyl-3-O-p-coumaroylglycerol。

化合物18[M-H]-=443.35 6，[A1-H]-=193.051 3是阿魏酸脱去1个H，[M-A-H]-=249.079 1是母核上脱去1分子阿魏酸，[A1-COOH-OH·]-=134.038 6是阿魏酸发生了脱羧反应并且苯环上脱去1个羟基，[2A1-2H+C3H6]-=428.112 5是两分子阿魏酸被1分子C3链连接。结合文献报道[15]，推测分子式为C23H24O9，命名为1,2-O-diferuloylglycerol。

化合物19[M-H]-=881.453 9，[Rha-H]-=163.062 6是鼠李糖失去1个H，[Glu-H]-=179.056 5是葡萄糖失去1个H，[M-OH-methylglutaryl]-=737.411 7是母核上脱下1个羟基和1个甲基戊二酰基。结合文献报道[13]，推测其分子式为C45H70O17，命名为(25R)-27-O-3-hydroxy-3-methylglutaryl-spirosol-5-en-3β-ylO-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside。

综上所述，表1和表2中的结果表明：龙牙百合鲜样中所含化合物的种类和含量明显多于干样。

4 讨论

目前，关于百合鳞茎中挥发性成分的研究报道较少，采用HS-SPME-GC-MS法分析龙牙百合鳞茎中挥发性成分未见报道。傅春燕等[16]采用超临界流体CO2萃取，通过GC-MS法对百合中的挥发性成分进行了鉴定，表明百合中含有多种挥发性成分，超临界流体CO2萃取技术与水蒸气蒸馏法相比，效率更高、所得成分更多。但是，与水蒸气蒸馏法、超临界流体CO2萃取相比，固相顶空微萃取技术具有省时省力、节约试剂的特点，并且可以避免因高温引起的成分降解[17]。

图4 龙牙百合干样和鲜样负离子模式下HPLC-Q-TOF-MS总离子流图(TIC)Fig.4 The total ions chromatogram (TIC) of HPLC-Q-TOF-MS in negative ion mode of dry and fresh Longya lily

表3 龙牙百合鲜样HPLC结果及负离子模式下HPLC-Q-TOF-MS离子碎片信息

续表3(Continued Tab.3)

表4 龙牙百合干样HPLC结果及负离子模式下HPLC-Q-TOF-MS离子碎片信息

图5 12个酚酸类化合物和1个木脂素类化合物分子结构Fig.5 The chemical structures of 12 phenolic acids and 1 lignans

图6 6个甾体皂苷分子结构Fig.6 The chemical structures of six steroidal saponins

酚类化合物属于植物次生代谢产物，是中药材中具有药理活性的成分，如：抗炎、抗氧化、防止动脉粥样硬化等作用[18]。目前，根据已有的对百合化学成分的研究表明，百合中含有多种酚类化合物，这些化合物属于酚酸甘油酯/苷(苯丙素类化合物)。Munafo等[19]，通过LC-MS分离并鉴定了5种苯丙素甘油酯苷；Thi等[8]从百合花中分离得到三种苯丙素甘油酯苷，并且通过抗炎、抗氧化试验，结果表明三种化合物均具有显著的抗炎和抗氧化活性。百合属植物中含有较多甾体皂苷，自1990年以来，研究报道相对较多，据笔者不完全统计，截至目前从各品种百合中分离、鉴定的甾体皂苷约有50余种[10]。

本文通过HPLC-Q-TOF-MS法，采用ESI离子源，在负离子模式下从新鲜龙牙百合中共鉴定了12个酚酸类化合物、6个皂苷类化合物和1个木脂素类化合物，其中，化合物1、3、6、10、12、14、16、17、18等9个化合物在龙牙百合中属首次鉴定。

此外，龙牙百合鲜样和干样中化学成分的种类及含量差异较大，结合生产工艺来看[20]，干百合加工过程中需要经历漂洗、105 ℃的杀青和多步骤的热风干燥等工艺环节，可能是在这些工艺环节中产生的高温、光照等因素导致这些组分出现了降解或转化，但是在鲜百合至干百合这一加工过程中导致甾体皂苷和酚酸类化合物种类减少、含量降低以及挥发性成分降解和转变的详细原因仍有待进一步研究。

5 结论

综上所述，龙牙百合中的挥发性成分不仅存在于花叶中，在鳞茎中也比较丰富。此外，固相顶空微萃取技术在对少量样品的分析里具有较大的优势，适宜于对百合鳞茎中挥发性成分的提取，结合GC-MS固有的高效性和准确性，可以实现对龙牙百合鳞茎中挥发性成分从提取到分析过程中的时效性、精确性。

龙牙百合中含有多种酚酸类化合物和甾体皂苷，其中，酚酸类化合物主要由香豆素酸、咖啡酸、阿魏酸等由一分子甘油连接，并在甘油基团上发生对位/邻位取代或葡萄糖取代或乙酰化构成。此外，采用HPLC-Q-TOF-MS可以快速地对龙牙百合中的酚酸类和甾体皂苷类化合物进行分离鉴定。

结果同时表明，新鲜龙牙百合中所含的甾体皂苷、酚酸类(苯丙素类)化合物的种类及含量均高于龙牙百合干，挥发性成分的组成也具有较大差异。因此选择合适的干燥工艺，避免活性成分的损失是百合初加工过程中要注意的问题。