不同品种黄麻叶多糖的理化特征及抗氧化活性研究

冯湘沅，成莉凤，谢纯良，杨 琦，刘志远，郑 科，段盛文，彭源德

中国农业科学院麻类研究所，长沙 410205

黄麻属于一年生草本椴树科植物，原产于东南亚，约有100多个品种[1]，其叶的形状为卵圆状披针形或披针形，含有黄麻甙、β-谷甾醇、β-谷甾醇D-葡萄糖甙、黄麻酮及单糖类组分等化学成分。据《本草纲目拾遗》、《陆川本草》等记载：具有理气止血、排脓生肌等功能[2]。国内外学者不断地深入研究黄麻品种、营养等，Li等[3]进行了菜用黄麻嫩梢营养与分析研究，Lin等[4]进行了菜用黄麻新品种福农1号的选育研究；Phuwapraisirisan等[5]研究了长蒴黄麻苷A、B的降血糖作用，Yamazaki等[6]研究了长蒴黄麻叶水提物的高粘性水胶体的成分等，但是，针对不同品种黄麻叶多糖的结构、分子量以及抗氧化活性等系统研究鲜见报道。

人体在生命活动代谢过程中会不断地产生自由基，而过量自由基与许多疾病的发生有着密不可分的联系，如：羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基等异常过多能破坏细胞膜，干扰细胞的新陈代谢；加快肌体衰老，引发心脑血管疾病；侵蚀机体组织，导致各种非菌性炎症等，对人体健康造成严重的影响[7,8]。多糖具有抗炎、抗衰老、抗凝血、抗溃疡、抗肿瘤及促进免疫等功效[9]。近些年来，随着人们对身体健康保护意识逐渐增强，多糖作为保健品的主要成分备受人们青睐。

由于多糖具有大量的羟基，遇水容易溶出，而乙醇又能使多糖沉淀，实验安全且易操作，故本文采用热水浸提-醇沉法提取不同品种黄麻叶中多糖，并针对多糖的含量、结构、分子量、单糖组成及抗氧化活性进行比较分析，旨在为黄麻的种植及功能性保健产品的综合开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：采摘于中国农业科学院麻类研究所长沙实验基地种植的不同品种黄麻叶(苗后天数均为28天)，分别为：1.圆果种黄麻叶(品系名称：英德深红皮，特征为红茎、绿叶、叶脉较稀、无光泽)；2.长果种黄麻叶(品系名称：中黄麻4号，特征为绿茎、绿叶、叶脉较密、有光泽)。

1.2 主要仪器与试剂

仪器：高效液相色谱仪(Dionex Ultimate 3000)，色谱柱(Xtimate C184.6×200 mm，5 μm)，粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司，FZ102)，恒温振荡器(金坛市天竟实验仪器厂，SHZ-82型)，全波长酶标分析仪(Thermo Fisher，multiskan Go型)，凝胶渗透色谱仪(Agilent 1100，Agilent Technologies，USA)，Nicolet iS 10光谱仪(Thermo Fisher Scientific，USA)，离心机(SiGmA，3k15型)。

试剂：无水乙醇、FeSO4、H2O2、Tris、二苯代苦味酰肼自由基、水杨酸、邻苯三酚、L-抗坏血酸(VC)、三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司产品，分析纯)；甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖(美国Sigma公司)。

1.3 多糖样品的制备[10]

将黄麻叶洗净，50 ℃烘干，粉碎，过45目筛(平均粒径为0.35±0.02 mm)；精确称取5.0 g黄麻叶粉末于500 mL三角瓶中，加150 mL超纯水，于60 ℃、150 rpm恒温水浴振荡器加热振荡5 h后，冷却至室温；再移入离心管于8 000 rpm离心10 min，收集上清液，即得提取液。

取100 mL上清液加入400 mL无水乙醇，搅拌，静置，弃溶液，收集黄色絮状物，干燥得多糖固形物。

样品：精确称取一定量的多糖固形物分别配制成所需不同浓度溶液。

1.4 测定方法

1.4.1 多糖含量测定

多糖含量参照Yu等[11]采用的硫酸-苯酚法测定进行。

标准溶液配制：精确称取100 mg葡萄糖(105 ℃干燥恒重)于100 mL容量瓶中溶解，定容至刻度，摇匀，即得浓度为1 mg/mL葡萄糖标准溶液，适度稀释不同浓度溶液用作标准曲线测定。

提取液多糖含量的测定方法同上述标准溶液的测定。

多糖浓度(mg/mL)按葡萄糖标准曲线回归方程进行计算；多糖质量(mg)=多糖浓度×稀释倍数×总体积；多糖含量(mg/g)=多糖质量/粉末质量。

1.4.2 FT-IR光谱分析

取1mg样品与100 mg KBr(干燥)混合，放入玛瑙研钵中研磨10 min后，压入盘中，用Nicolet iS 10光谱仪在4 000～400 cm-1范围进行扫描。

1.4.3 单糖组成

1.4.3.1 HPLC检测条件

1.4.3.2 衍生方法

标准品溶液配制：精密称取适量甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖对照品，加水溶解稀释至每1 mL中各含50 μg的混合标准对照溶液。

标准品溶液衍生步骤：精确吸取250 μL标准品溶液到5 mL EP管中，加入250 μL NaOH(0.6 mol/L)，500 μL PMP(0.4 mol/L)-甲醇，70 ℃反应1 h，冷却10 min；加入500 μL HCl(0.3 mol/L)中和，再加入1 mL三氯甲烷漩涡1 min，3 000 rpm离心10 min，收集上清(萃取重复3次)，上清液用于HPLC分析。

样品水解：精确称取适量样品至5 mL安培瓶中，加入2.0 mL TFA(2 mol/L)于5 mL安瓿中，封管，110 ℃酸解8 h，取出挥干TFA，加2.0 mL水复溶。

样品溶液衍生：参照标准品溶液衍生，将样品溶液衍生后稀释10倍用于HPLC分析。

1.4.4 多糖分子量的测定

使用PL aquagel-OH Mixed 8 mm凝胶渗透色谱仪测定多糖分子量。

随着我国风电等间歇性电源的大规模发展，电力系统调峰需求将逐渐增大。天然气发电机组启动迅速，调节方便，具有较强的调峰能力，对电力系统的安全稳定运行可以起到重要的保障作用。

1.5 抗氧化活性测定

1.5.1 自由基清除率的测定

羟基自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基的清除率均分别参照Huang等[12]测定中采用的水杨酸法、二苯代苦味酰肼自由基、邻苯三酚法法进行，同时以VC(强抗氧化剂)作为对照。

1.5.2 EC50值

EC50值是指自由基清除率为50%时所需样品的浓度，该值根据回归方程计算得出。EC50值越低，抗氧化活性越高[13]。

1.6 数据处理方法

实验数据均取平行3次测量值的平均值和标准偏差，同时采用Excel软件作图分析。

2 结果与分析

2.1 多糖的理化特征分析

2.1.1 多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法对不同浓度葡萄糖溶液测定(图1)，以浓度(x)为横坐标和吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线回归方程为y=11.511x+0.033 3，R2=0.996 6。根据标准曲线回归方程计算出的圆果种黄麻叶、长果种黄麻叶提取液中多糖含量分别为80.92、60.77 mg/g，圆果种黄麻叶多糖含量高于长果种黄麻叶多糖。

2.1.2 FT-IR光谱分析

如图2所示，圆果种黄麻叶多糖、长果种黄麻叶多糖分别在3 283 cm-1和3 264 cm-1处出现的吸收峰是属于多糖分子内或分子间-OH的拉伸振动特征，这主要是由多糖苷的延伸振动引起的；两者同时在1 403 cm-1处出现的吸收峰表示为C-O伸缩振动；分别在1 036 cm-1和1 026 cm-1处出现的吸收峰，表示是由消旋引起的吡喃糖环的拉伸振动[14]。这些吸收峰说明两种黄麻叶多糖通过FT-IR光谱在4 000～400 cm-1下测定具有非常相似的吸收带，且含有葡聚糖的典型红外光谱信号，均属于多糖类物质的典型特征。

图2 不同品种黄麻叶多糖的红外光谱图Fig.2 Infrared spectra of polysaccharides from jute leaves of different varieties 注：A.圆果种黄麻叶多糖；B.长果种黄麻叶多糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius.

2.1.3 分子量测定

经PL aquagel-OH Mixed 8 mm凝胶渗透色谱分析仪检测获得不同品种黄麻叶多糖GPC色谱图见图3，圆果种黄麻叶多糖出峰保留时间分别在9.791、12.842、15.618 min时，峰面积占比分别为1.88%、1.84%、96.28%；长果种黄麻叶多糖出峰保留时间分别在9.784、12.823、15.650 min时，峰面积占比分别为3.55%、4.46%、91.99%，根据保留时间、峰面积换算，圆果种黄麻叶多糖、长果种黄麻叶多糖的平均摩尔分子量分别为59.87 kDa和102.54 kDa。结果表明，两种不同黄麻叶多糖样品的出峰保留时间、峰面积占比存在着差异，说明分子量有差别。

图3 不同品种黄麻叶多糖的GPC色谱图Fig.3 GPC chromatogram of polysaccharides from jute leaves of different varieties注：A.圆果种黄麻叶多糖；B.长果种黄麻叶多糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius.

2.1.4 单糖组成分析

样品经水解衍生、HPLC法分析检测，对照标准品获得水解产物的单糖组成色谱图以及数据由图4、表1可知：除氨基半乳糖外，两种样品多糖均含有甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、岩藻糖等11种单糖成分。其中圆果种黄麻叶多糖中含量最多的为半乳糖(质量分数为27.06%)，其次甘露糖(质量分数为18.48%)，但氨基半乳糖含量未检测到；而长果种黄麻叶多糖中含量最高的为葡萄糖(质量分数为44.55%)，其次半乳糖(质量分数为20.24%)，但出现有氨基半乳糖(质量分数为0.03%)，含量最低；圆果种黄麻叶多糖中葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量分别较长果种黄麻叶多糖高6.47%和0.50%。

图4 不同品种黄麻叶多糖的单糖组成色谱图Fig.4 Chromatogram of monosaccharide compositions of polysaccharides from jute leaves of different varieties注：A.圆果种黄麻叶多糖；B.长果种黄麻叶多糖；S.标准品：1.甘露糖；2.核糖；3.鼠李糖；4.葡萄糖醛酸；5.半乳糖醛酸；6.氨基葡萄糖；7.葡萄糖；8.氨基半乳糖；9.半乳糖；10.木糖；11.阿拉伯糖；12.岩藻糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius;S.Standards:1.Mannose;2.Ribose;3.Rhamnose;4.Glucuronic acid;5.Galacturonic acid;6.Glucosamine;7.Glucose;8.Aminogalactose;9.Galactose;10.Xylose;11.Arabinose;12.Fucose.

表1 不同品种黄麻叶多糖的单糖组成测定

2.2 抗氧化活性测定

2.2.1 清除羟基自由基能力

由图5可知，圆果种黄麻叶多糖、长果种黄麻叶多糖对羟基自由基清除率均随浓度的增加而增大，但圆果种黄麻叶多糖的羟基自由基清除率均高于长果种黄麻叶多糖。如：当多糖浓度为1 mg/mL时，圆果种黄麻叶多糖、长果种黄麻叶多糖对羟基自由基清除率分别为46.23%、41.81%，圆果种黄麻叶多糖的清除率较长果种黄麻叶多糖提高4.42%。

EC50值计算结果由表2可看出，圆果种黄麻叶多糖对羟基自由基清除能力的EC50值(1.14 mg/mL)小于长果种黄麻叶多糖的EC50值(1.32 mg/mL)。从多糖浓度在0.2～1.4 mg/mL范围来看，圆果种黄麻叶多糖对羟基自由基清除能力稍强于长果种黄麻叶多糖，但两者多糖其清除能力均较VC(强抗氧化剂)弱。

图5 不同品种黄麻叶多糖和VC对羟基自由基清除能力Fig.5 The scavenging ability of polysaccharides from jute leaves of different varieties and VC on hydroxyl free radicals注：A.圆果种黄麻叶多糖；B.长果种黄麻叶多糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius.

2.2.2 清除DPPH自由基能力

从图6可得，圆果种黄麻叶多糖、长果种黄麻叶多糖和VC对DPPH自由基清除率分别由0.2 mg/mL时36.18%、27.2%、88.58%增加到1mg/mL时67.30%、61.11%、93.25%，其清除率均与浓度呈正相关。从整体变化规律来看，其清除率都呈上升趋势，但VC其清除率最高，圆果种黄麻叶多糖次之，长果种黄麻叶多糖最低。

EC50值结果(表2)表明，圆果种黄麻叶多糖对DPPH自由基清除能力(EC50值0.43 mg/mL)较长果种黄麻叶多糖(EC50值0.69 mg/mL)强。

2.2.3 清除超氧阴离子自由基能力

由图7可看出，圆果种黄麻叶多糖、长果种黄麻叶多糖对超氧阴离子自由基清除率均随浓度的增加而逐渐增强，但VC其清除率增大趋势较缓。当浓度为1mg/mL时，圆果种黄麻叶多糖、长果种黄麻叶多糖和VC对其清除率分别为75.02%、66.81%、90.11%。

图6 不同品种黄麻叶多糖和VC对DPPH自由基清除能力Fig.6 The scavenging ability of polysaccharides from jute leaves of different varieties and VC on DPPH free radicals 注：A.圆果种黄麻叶多糖；B.长果种黄麻叶多糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius.

EC50值(表2)结果显示，圆果种黄麻叶多糖、长果种黄麻叶多糖对超氧阴离子自由基清除能力的EC50值分别为0.37、0.57 mg/mL，结果表明，圆果种黄麻叶多糖对超氧阴离子自由基清除能力明显优于长果种黄麻叶多糖，但与VC对照相比，两者多糖对其清除能力均较弱。

3 讨论与结论

本研究是在固液比1∶30、温度60 ℃、转速150 rpm恒温水浴振荡器加热振荡5 h条件下，利用醇沉法对不同品种黄麻叶(苗后天数均为28天)提取多糖，采用硫酸-苯酚法测得圆果种黄麻叶多糖、长果种黄麻叶多糖的含量分别为80.92、60.77 mg/g；凝胶渗透色谱检测相应平均摩尔分子量分别为59.87、102.54 kDa；红外光谱显示圆果种黄麻叶和长果种黄麻叶的多糖结构出现有极其相似的吸收峰，均具有多糖类物质的典型结构；水解衍生-HPLC法测得圆果种黄麻叶多糖和长果种黄麻叶多糖均含有半乳糖、甘露糖、核糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等11种单糖，其中圆果种黄麻叶多糖是以半乳糖(质量分数为27.06%)、甘露糖(质量分数为18.48%)为主要单糖成分；长果种黄麻叶多糖则是以葡萄糖(质量分数为44.55%)、半乳糖(质量分数为20.24%)为主要单糖成分，但圆果种黄麻叶多糖中葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量分别较长果种黄麻叶多糖高6.47%和0.50%。通过结果表明，圆果种黄麻叶多糖的含量高于长果种黄麻叶多糖，两种多糖理化特征存在着差异，这些差异的产生可能主要与原料品种有关，说明不同品种黄麻叶中含有不同的多糖类物质。

多糖作为提取物，许多研究均表明多糖具有较强的抗氧化活性，如：Bi等[15]、Jiao等[16]及Ni等[17]分别研究报道了真菌多糖、甜茶叶多糖及黄芪多糖的抗氧化活性，在质量浓度1mg/mL时，其相应DPPH自由基清除率为55%、63.7%和72.9%。而本研究结果显示，圆果种黄麻叶多糖和长果种黄麻叶多糖在浓度1mg/mL时，其DPPH自由基清除率分别为67.30%和61.11%，与文献[15,17]相比，圆果种叶多糖的DPPH自由基清除能力高于真菌多糖和甜茶叶多糖，但较黄芪多糖低。本研究中的抗氧化活性结果显示，圆果种黄麻叶多糖、长果种黄麻叶多糖均能对羟基自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基有着不同程度的清除效果，且清除率与多糖浓度剂量呈正相关，但圆果种黄麻叶多糖对自由基清除能力的EC50值均低于长果种黄麻叶多糖。表明两种黄麻叶多糖具有一定的抗氧化能力，是有待于开发的抗氧化活性物质。

在本研究条件下，圆果种黄麻叶多糖抗氧化活性较长果种黄麻叶多糖强，可能与多糖的糖醛酸类单糖含量高低以及分子量大小有关，这一结论与文献[18,20]报道相吻合，可为黄麻叶多糖的深入研究和资源开发提供一定的参考，但针对有效成分的最佳提取方法与种植最适采摘时间的关系等有待于进一步探讨。