川麦冬须根总黄酮和总皂苷提取和富集工艺研究

刘晓梅，李沛霞，甘蓝湘，晋 艳，黄 毅，江洪波，金 虹*

1四川中医药高等专科学校，绵阳 621000；2西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳 621010；3成都中医药大学药学院，成都 611137

川麦冬，又名“绵麦冬”或“涪城麦冬”，为百合科植物麦冬(Ophiopogonjaponicus(L.f)Ker-Gawl)的干燥块根，始载于《神农本草经》，列为上品，具有养阴生津，润肺清心的功效。临床多用于治疗肺燥干咳、喉痹咽痛和肠燥便秘等症状[1]。现代研究表明，麦冬主要化学成分为甾体皂苷、黄酮和多糖等，具有降血糖、保护心血管系统、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[2-5]，本课题组在前期研究中还发现麦冬须根的皂苷及黄酮提取组分对小鼠肺部气道损伤具有明显的保护作用[6]。

目前市售麦冬主产于四川、浙江和江苏等地，其中川麦冬产量最大。中国药典规定麦冬药用部位为块根。采摘加工1 000 kg块根会产生300 kg须根，后者在加工过程中作为非药用部位被弃用，造成极大的资源浪费[7]。近年来，很多研究显示，麦冬须根的主要活性成分、安全性与块根相似，其中总皂苷、多糖等含量还明显高于麦冬块根[8-12]。2019年4月，四川省发布了《麦冬须根食品安全地方标准》[13]，将川麦冬须根正式列为新食品资源，显示出极大的食用开发价值和应用前景。

现有文献报道麦冬的提取工艺[14,15]，而有关川麦冬须根的提取富集工艺尚未见相关报道。本研究以国内麦冬最大的种植基地—四川三台县的川麦冬须根为研究对象，采用响应面法优化总皂苷及总黄酮提取工艺，并进一步通过大孔树脂富集这两类组分，为后续川麦冬须根资源的合理利用和新产品的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

川麦冬须根：2019年4月采集于四川省绵阳市三台县花园镇川麦冬种植基地；鲁斯可皂苷元和芦丁对照品(纯度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司)；正丁醇、无水乙醇、高氯酸、氨水、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(均为分析纯，成都科龙化学品有限公司)；9种大孔吸附树脂(D101、AB8、DM301、DA201、H103、HPD100、D3520、HP20和H1020，蚌埠市天星树脂有限责任公司)；纯水为实验室自制。

1.2 仪器与设备

电子分析天平(Sartorius BP121s，德国Sartorius公司)；紫外-可见分光光度计(UV-1100型，中国上海天美科技有限公司)；旋转蒸发仪(RE-52AA，中国上海亚荣生化仪器厂)；离心机(D1008E，美国赛洛捷克有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮和总皂苷含量测定

1.3.1.1 总黄酮标准曲线

参考Xu等[16,17]的方法制备芦丁标准曲线。精密量取芦丁对照品溶液(0.2 mg/mL)1、2、3、4、5、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各补加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀放置6 min后，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，并放置6 min后，加氢氧化钠试液10 mL，再补加水至刻度，摇匀放置15 min，对照空白溶液在500 nm波长处测定吸光度。以芦丁标准品浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，得到标准品溶液浓度(X，mg/mL)与吸光度(Y)的线性回归方程Y=10.116X-0.014 4(R2=0.999 9)，结果表明芦丁标准品溶液在0.016 3～0.081 4 mg/mL内具有良好的线性关系。

图1 芦丁标准品溶液的标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin solution

1.3.1.2 总皂苷标准曲线

参考2015版中国药典[1]麦冬项下方法制作鲁斯可皂苷元标准曲线。精密量取鲁斯可皂苷元对照品溶液(50 μg/mL)0.5、l、2、3、4、5和6 mL，分别置具塞试管中于水浴下挥干溶剂，加人高氯酸10 mL，摇匀，置热水中保温15 min，冷却后对照空白溶液，在397 nm波长处测定吸光度。以鲁斯可皂苷元标准品浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，得到标准品溶液浓度(X，mg/mL)与吸光度(Y)的线性回归方程Y=0.016X-0.006 6(R2=0.999 3)，结果表明鲁斯可皂苷元标准品溶液在2.5～30 μg/mL内具有良好的线性关系。

图2 鲁斯可皂苷元标准品溶液的标准曲线Fig.2 Standard curve of ruscogenin standard solution

1.3.2 提取工艺优化

1.3.2.1 浸膏得率及提取率测定

麦冬须根浸膏得率和黄酮(或皂苷)的得率采用公式(1)、(2)计算：

(1)

(2)

式中：C为提取液中黄酮(或皂苷)的浓度，mg/mL；V为提取液的体积，mL；M1为浸膏质量，g；M2为麦冬须根样品的质量，g。

1.3.2.2 单因素试验

以黄酮和皂苷总得率为指标，对乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数四个因素进行考察，为后面响应面法优化工艺确定各参数范围。根据前期预实验结果，在固定其余参数情况下，考察了乙醇浓度：0%、20%、40%、60%、80%和100%；料液比(质量比体积)：1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15和1∶20；提取时间：0.5、1、1.5、2和2.5 h；提取次数：1、2、3、4和5次。

1.3.2.3 响应面优化试验

以单因素试验结果为基础，采用Design Expert V8.0.6.1软件，以皂苷和黄酮的总得率为响应值，以乙醇浓度、液料比、提取时间和提取次数为因素，进行响应面优化以便筛选最优提取条件。试验设计因素水平见表1。在获得最佳工艺条件后，结合实际应用修正工艺参数并进行三次验证试验。

表1 响应面试验设计因素水平表

1.3.3 大孔树脂富集

1.3.3.1 树脂筛选

取提取液，加入等体积无水乙醇，涡旋混匀，10 000 rpm离心30 min，取上清液旋至无醇味，加水溶解并通过0.45 μm滤膜过滤，即为上样液。

分别称取按说明书预处理后的9种大孔树脂各2 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入30 mL上样液，于恒温摇床(25 ℃，180 rpm)振荡吸附12 h，取出滤液，测定滤液中黄酮和皂苷的含量，并按照公式(3)计算吸附率。将充分吸附后的9种树脂分别置于100 mL具塞锥形瓶中，各加入30 mL无水乙醇，于恒温摇床(25 ℃，180 rpm)振荡解析12 h，取出滤液，测定滤液中黄酮和皂苷的含量，并按照公式(4)计算解吸率。

(3)

(4)

式中：C0为起始样品液中皂苷(或黄酮)质量浓度，mg/mL；C1为吸附12 h后滤液中皂苷(或黄酮)质量浓度，mg/mL；C2为解吸液中总皂苷(总黄酮)质量浓度，mg/mL；V1为样品液体积，mL；V2为解吸液体积，mL。

1.3.3.2 最优洗脱剂体积分数摸索

取预处理好的大孔树脂10 g，湿法装柱，蒸馏水洗至无色，再分别用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%的乙醇溶液洗脱，流速为3.0 mL/min，洗脱体积为6个柱床体积(BV)，收集洗脱液，测定其总黄酮和总皂苷含量，计算解吸率，筛选最优洗脱剂体积分数。

1.3.3.3 总皂苷和总黄酮的富集

称取预处理好的大孔树脂10、20和50 g，湿法装柱，上样吸附至饱和，蒸馏水洗至无色，再按上述最佳洗脱条件进行洗脱，收集洗脱液测定总黄酮和总皂苷含量，并计算纯度和回收率，验证工艺效果和稳定性。

(5)

(6)

式中：C1为富集前黄酮(或皂苷)质量浓度，mg/mL；V1为富集前溶液体积，mL；C2为富集后总黄酮(或总皂苷)质量浓度，mg/mL；V2为富集后定容体积，mL；M为富集后样品质量，g。

1.3.4 数据处理

所有试验均重复三次，采用Excel 2010、SPSS 20.0和Design Expert 8.0.6软件对数据进行处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对黄酮和皂苷总得率的影响

当乙醇浓度在0～80%时，麦冬须根中黄酮和皂苷总得率随乙醇浓度的增大而增加(图3)。当乙醇浓度继续增加后，总得率反而降低，这可能是因为乙醇浓度过大，会使部分醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，影响黄酮和皂苷的总提取效率。方差分析结果表明，60%与80%、100%之间没有显著性差异，其余各水平之间均有显著性差异。因此，选择乙醇浓度70%、80%、90%为响应面设计的三个水平。

图3 乙醇浓度对皂苷和黄酮总得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the total yield of saponins and flavonoids 注：料液比1∶20;提取1 h;提取1次。Note:Solid-liquid ratio is 1∶20;Extraction time is 1 h;Extraction times is one time.

图4 料液比对皂苷和黄酮总得率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the total yield of saponins and flavonoids 注：乙醇浓度为100%;提取1 h;提取1次。Note:Ethanol concentration is 100%;Extraction time is 1 h;Extraction times is one time.

2.1.2 料液比对黄酮和皂苷总得率的影响

由图4可知，随着溶剂体积的增加，麦冬须根中黄酮和皂苷总得率逐渐升高，当料液比达到1∶12(g/mL)时，其总得率趋于平衡，再增加溶剂体积，黄酮和皂苷的得率变化不大。方差分析结果表明，料液比1∶12与1∶15、1∶20之间，1∶15与1∶20之间没有显著性差异，其余各水平均有显著性差异。因此，选择料液比1∶10、1∶12、1∶15(g/mL)为响应面设计的三个水平。

2.1.3 提取时间对黄酮和皂苷总得率的影响

由图5可知，随着热回流时间的增加，黄酮和皂苷总得率呈现先升后降的趋势，当提取时间达到1.5 h时，其总得率最高，但随着时间的延长，黄酮和皂苷类物质稳定性变差，会导致得率降低。方差分析结果表明，0.5 h与1 h之间，1.5 h与2 h、2.5 h之间，2 h与2.5 h之间没有显著性差异，其余各水平均有显著性差异。因此，选择热提取时间为1、1.5、2 h为响应面设计的三个水平。

图5 提取时间对皂苷和黄酮总得率的影响Fig.5 Effect of extraction time on the total yield of saponins and flavonoids注：乙醇浓度为100%;料液比1∶10;提取1次。 Note:Ethanol concentration is 100%;Solid-liquid ratio is 1∶10;Extraction times is one time.

图6 提取次数对皂苷和黄酮总得率的影响Fig.6 Effect of extraction times on the total yield of saponins and flavonoids 注：乙醇浓度为100%;料液比1∶10;提取1 h。Note:Ethanol concentration is 100%;Solid-liquid ratio is 1∶10;Extraction time is 1 h.

2.1.4 提取次数对黄酮和皂苷总得率的影响

由图6可知，随着提取次数的增加，黄酮和皂苷总得率逐渐升高。方差分析结果表明，2、3、4、5次之间均没有显著性差异，1次与2、3、4、5次之间均有显著性差异，说明次数为2时，其总得率趋于平衡，再增加提取次数，其总得率没有显著性增加。因此，选择提取次数1、2、3次为响应面设计的三个水平。

2.2 麦冬须根总黄酮和总皂苷提取工艺优化

2.2.1 响应面试验结果

在单因素试验基础上，以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)为因素，以皂苷和黄酮的总得率为响应值，设计四因素三水平响应面试验，共计29组试验点，响应面试验设计和结果见表2。

表2 响应面试验设计方案与试验结果

利用Design-Expert V8.0.6.1软件对表2中数据进行二次多元回归拟合，得到总得率Y与A、B、C、D二次多项式回归方程为Y=2.18+0.12A+0.062B+0.017C+0.16D+0.054AB+0.045AC+0.067AD-0.074BC-0.020BD+0.01CD-0.21A2-0.033B2-0.066C2-0.060D2。

对表2中的试验结果进行统计分析，所得方差分析结果见表3。结果表明，该模型极显著(P<0.01)，其中R2=0.9485，表明模型响应值变化的94.85%来自考察的变量。回归方程失拟项F=4.05，P=0.095 1>0.05，失拟项不显著，说明该方程对试验拟合情况好，误差小，表明应用响应面法优化麦冬须根中总皂苷和总黄酮的提取工艺是可行的。由F值可知，各因素对皂苷和黄酮总得率影响大小顺序为提取次数(D)>乙醇浓度(A)>液料比(B)>提取时间(C)，且一次项A、B、D对总含量的影响极显著，C影响不显著；二次项中A2对总含量影响极显著，C2、D2影响显著，其余不显著；交互项中AD、BC对总含量影响显著，其余不显著。

表3 模型方差分析结果

2.2.2 响应面各因素交互作用分析

通过Design-Expert V8.0.6.1软件处理，得到两因素间的交互作用响应面分析图，见图7～12。响应面坡度越陡峭，说明响应值对于该因素的改变越敏感，而曲面坡度越平滑，该因素对响应值的影响也就越小。图7、8、11、12曲面较平滑，说明该两因素之间交互作用影响不显著。图9和图10的响应面坡度陡峭，说明该两因素之间交互作用影响显著，该结果与表3分析结果一致。

图7 乙醇浓度(A)和料液比(B)对麦冬须根中黄酮和皂苷总得率影响的等高线和响应面图Fig.7 Contour map and response surface plots showing the mutual effects of different ethanol concentration (A) and solid-liquid ratio (B) on the total yield of saponins and flavonoids

图8 乙醇浓度(A)和提取时间(C)对麦冬须根中黄酮和皂苷总得率影响的等高线和响应面图Fig.8 Contour map and response surface plot showing the mutual effects of different ethanol concentration (A) and extraction time (C) on the total yield of saponins and flavonoids

图9 乙醇浓度(A)和提取次数(D)对麦冬须根中黄酮和皂苷总得率影响的等高线和响应面图Fig.9 Contour map and response surface plots showing the mutual effects of different ethanol concentration (A) and extraction times (D) on the total yield of saponins and flavonoids

图10 料液比(B)和提取时间(C)对麦冬须根中黄酮和皂苷总得率影响的等高线和响应面图Fig.10 Contour map and response surface plots showing the mutual effects of different solid-liquid ratio (B) and extraction time (C) on the total yield of saponins and flavonoids

图11 料液比(B)和提取次数(D)对麦冬须根中黄酮和皂苷总得率影响的等高线和响应面图Fig.11 Contour map and response surface plots showing the mutual effects of different solid-liquid ratio (B) and extraction times (D) on the total yield of saponins and flavonoids

图12 提取时间(C)和提取次数(D)对麦冬须根中黄酮和皂苷总含量提取的影响Fig.12 Contour map and response surface plots showing the mutual effects of different extraction time (B) and extraction times (D) on the total yield of saponins and flavonoids

2.3 最佳提取工艺条件的验证试验

由试验和分析数据预测，热回流提取麦冬须根中总皂苷和总黄酮最佳条件为：乙醇浓度为85.372%，料液比1∶15，提取1.4 h，提取3次，此条件下皂苷和黄酮总含量2.35%。这里需要注意一个问题，3次提取次数与单因素实验结果(2次)不一致，这主要是因为单因素实验限定了其它参数范围，没有考虑相互作用。实验最终结果2.35%也高于单因素实验的最高结果2.27%，说明响应面优化更有效。

按照优化工艺条件，结合实际应用，将热回流最佳参数修正为：乙醇浓度为86%、料液比1∶15、提取1.4 h、提取3次，实验结果见表4。浸膏得率为26.17%，总黄酮和总皂苷平均得率分别为0.46%和1.95%，总得率为2.41%，相对标准偏差为1.90%，与理论预测值2.35%的偏差为2.60%，小于5%，说明建立的模型预测性良好，优选的工艺稳定可行。

表4 验证试验结果

2.4 大孔吸附树脂的筛选

对9种树脂进行静态吸附和解吸试验结果见表5。在吸附率上，D101、AB-8和H103排名前三，这三种树脂对黄酮和皂苷均表现很好的吸附效果；而在洗脱过程中，D101型树脂对黄酮和皂苷均表现出很好的解吸效果。综合吸附率与解吸率两项指标，本研究选用D101大孔树脂富集纯化麦冬须根中的黄酮和皂苷。

2.5 大孔树脂富集结果

2.5.1 洗脱剂浓度

图13所示，随着乙醇体积分数的增加，D101大孔树脂对黄酮和皂苷解吸率逐渐增加，当乙醇体积分数达到70%时，解吸率达到最高。继续增加乙醇体积分数，解吸率趋于平衡。由于洗脱剂对黄酮和皂苷类化合物的解吸效果基本具有一致性，所以不易通过分段洗脱分别收集总皂苷和总黄酮部分，故选取最优洗脱剂乙醇体积分数为70%。

表5 9种大孔吸附树脂静态吸附和解吸率

图13 洗脱剂浓度对解吸率的影响Fig.13 Effect of eluent concentration on desorption ratio

2.5.2 富集工艺放大验证

选取D101大孔树脂，湿法装柱，蒸馏水洗至无色，再以70%乙醇溶液洗脱，流速为2.0 mL/min，洗脱体积5 BV。结果表明，经过不同树脂量的大孔树脂柱富集后，黄酮和皂苷纯度达到12.18%和45.74%，相对于提取液(黄酮纯度1.77%，皂苷纯度4.85%)分别提高了约7倍和9倍，回收率也分别达到了88.69%和90.28%，说明D101富集结果稳定可行。

表6 富集工艺试验结果

3 结论与讨论

Yin等[18]、Chen等[19]报道了麦冬块根中总黄酮提取率为0.13%和0.23%，Li等[14]报道总皂苷提取率为0.23%，这些文献仅考察了单一组分的提取，并没有考察同时提取黄酮和皂苷，目前也无文献报道川麦冬须根中这两种组分的提取工艺。本实验首次对川麦冬须根的总黄酮和总皂苷提取工艺进行研究，在单因素试验基础上，采用响应面法对麦冬须根中总黄酮和总皂苷的提取工艺进行了优化，确定最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数86%、料液比1∶15、提取1.4 h、提取3次。在此条件下，总黄酮得率0.46%，总皂苷得率1.95%，结果均优于上述文献。

大孔树脂对活性成分的富集和分离有较好的效果，可同时针对不同类型化合物的分离[20]。本试验中的总黄酮和总皂苷具有洗脱一致性而不易分开，该结果在一些文献中也有报道[21]，这可能与大孔树脂品种及样品差异有很大关系。本试验通过比较9种不同型号大孔树脂对麦冬须根黄酮和皂苷的静态吸附和解析性能，选择D101大孔树脂作为富集树脂，洗脱剂为70%乙醇、洗脱流速为2 mL/min、洗脱剂用量5 BV。富集后总黄酮和总皂苷回收率达到88.69%和90.28%，纯度相比浸膏分别提升7倍和9倍。利用这套参数，实验组在后续的30 kg级别的中试上也取得了相似的结果，显示该工艺对川麦冬须根中最具价值的黄酮和皂苷类有效组分的提取富集效果，操作简单且稳定性好，适用于产业化生产，对于川麦冬须根这一新食品资源的开发利用提供了重要的有效途径。