miRNA-21在多发性骨髓瘤患者骨髓中的表达及与预后的相关性

朱广伟 王 丹 高虎方 张新潮

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是以恶性浆细胞聚集血液、骨髓、尿液中出现单克隆蛋白为特征的1种恶性疾病，约占所有血液恶性肿瘤的10%[1]。该病在临床上主要表现为溶骨性病变、感染、肾功能受损、贫血等，多发病于老年人[2]。微小RNA(miRNAs)是一类长度约21～25 nt的非编码单链RNA分子，其能够与相应的mRNA的3’-非编码区结合，使其降解或抑制其翻译，从而调节细胞凋亡、分化、增殖等代谢过程[3-4]。miRNAs的表达变化可以用来监测多发性骨髓瘤的进展，也可以作为良好的多发性骨髓瘤诊断标记物[5]。当前研究表明miRNA-21与肿瘤发生、耐药、侵袭、转移等密切相关，miRNA-21可抑多个肿瘤抑制基因的表达，从而发挥促进细胞转化、肿瘤转移与侵袭等作用[6]。研究发现多发性骨髓瘤患者的外周血miRNA-21 比正常浆细胞高15倍左右[7]，但多发性骨髓瘤患者骨髓中miRNA-21表达情况及其意义还不明确。本文具体探讨了miRNA-21在多发性骨髓瘤患者骨髓中的表达及与预后的相关性，希望明确miRNA-21的检测意义。现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

2014年3月到2019年10月选择在本院诊治的多发性骨髓瘤患者62例作为MM组，诊断标准均依据世界卫生组织推荐的MM诊断标准。纳入标准：经病理确诊为多发性骨髓瘤；年龄30～70岁；首次发病；医院伦理委员会批准了此次研究；患者签署了知情同意书；临床与病理资料完整。排除标准：取样前经内分泌、放疗等治疗；严重心、肝、肾功能异常；临床与病理资料缺乏者。其中男性34例，女性28例；年龄32～68岁，平均年龄(58.22±3.19)岁；平均病程(4.11±0.12)年；平均体重指数(22.47±1.27)kg/m2；临床分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期20例，Ⅲ期10例；细胞学分型：成熟浆细胞型22例，幼浆细胞型16例，原浆细胞型10例，网状细胞型14例。

同期选择在本院进行骨髓捐献的健康人员62例作为对照组，其中男性32例，女性30例；年龄31～69岁，平均年龄(59.02±3.18)岁；平均体重指数(23.01±2.18)kg/m2。两组性别、体重指数、年龄等对比差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 骨髓miRNA-21检测

取所有入选者的骨髓样本1 ml左右，本均置于生化红色真空采样管中，取1 500 rpm/min离心10 min，取上层组织。提取总RNA(试剂盒购自QIAGEN公司)，取1 μl RNA 用Nano核酸紫外分析仪检测总RNA纯度与浓度。逆转录为cDNA，然后采用qPCR方法检测miRNA-21表达水平，正向引物序列：5'-GCGGCGAACATTCAACGATG-3'，反向引物序列:5'-GTGCAGGGTCCGAGG-3'，PCR条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 12 s、58 ℃40 s(40个循环)，读取荧光信号，计算2-ΔΔCt，即为miRNA-21的相对表达量。

1.3 检测指标

采用酶联免疫法检测与记录两组入选者的血清β2-MG、IgG、IgA水平，采用全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白(ALB)、血红蛋白(Hb)含量。所有患者随访至今(2020年3月1日)，记录预后与生存情况。

1.4 统计方法

在统计分析时应用的软件是SPSS 22.0，计量数据采用(均数±标准差)表示，组间比较采用独立样本t检验；计数数据采用百分比(%)表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用直线相关分析，多因素预测采用COX模型回归分析，检验水准α<0.05。

2 结果

2.1 miRNA-21相对表达水平对比

MM组的miRNA-21相对表达量(7.78±0.43)，显著高于对照组(1.10±0.11)(P<0.05，t=22.483)。

2.2 血液学指标对比

MM组的血清IgG、IgA、β2-MG值高于对照组，ALB、LDH与Hb值低于对照组，对比差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组血液学指标对比

2.3 预后情况

MM组患者随访至今(2020年2月1日)，平均随访时间(32.72±2.28)个月，死亡18例(均因MM死亡)，死亡率为29.0%。患者生存时间见图1。

2.4 相关性分析

直线相关分析显示：多发性骨髓瘤患者的预后死亡与miRNA-21、β2-MG、IgA、临床分期呈正相关性(P<0.05)，与ALB、LDH、Hb呈负相关性(P<0.05),见表2。

图1 MM组患者的累积生存函数图

2.5 危险因素分析

在62例MM组患者中，以患者随访预后死亡作为因变量，COX回归分析显示：miRNA-21、临床分期、β2-MG、Hb、ALB为影响多发性骨髓瘤患者预后死亡的主要因素(HR>1，P<0.05)，见表3。

3 讨论

多发性骨髓瘤是1种浆细胞的恶性肿瘤，好发于老年人[8]。随着医学技术的发展，虽然部分药物可控制患者的病情，但是很多患者容易复发，死亡率一直居高不下[9]。本研究显示MM组的血清IgG、IgA、β2-MG值高于对照组，ALB、LDH与Hb值低于对照组，对比差异都有统计学意义(P<0.05)。当前多发性骨髓瘤主要靠临床症状结合一些实验室指标如血清Hb、β2-MG、ALB等进行诊断监测，临床诊断的敏感性一直比较低，因此有必要探索新的多发性骨髓瘤相关生物标志物[10]。特别是多发性骨髓瘤的发病是1个逐步发展的过程，部分患者可由单克隆免疫球蛋白病可直接发展成该病，导致常规血液学指标检测也存在一定的误差[11]。

miRNA是1种小分子非编码RNA，具有保守内源性，miRNA调控人类基因组中1/3的编码基因，参与体内细胞的生长、增殖等，其中约40个miRNAs被研究报道与多发性骨髓瘤的发生与发展有一定的相关性[12]。外周血中的循环miRNA分子表达能反映相应组织器官的病理变化，在肿瘤中，旺盛新陈代谢可使得大量miRNA 分子进入血液循环，但是在骨髓中的表达还无相关报道。miRNA-21是研究比较多的miRNA 分子，在多种恶性肿瘤组织中表达异常，可作为区分恶性肿瘤与良性肿瘤的生物标志物[13]。本研究显示MM组的miRNA-21相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。从机制上分析，miRNA-21的成熟前体Pre-miRNA-21定位于染色体17p12，在多发性骨髓瘤中17p12位点可表现为激活状态，从而发挥促癌作用。当前也有研究显示miRNA-21与肿瘤进展关系密切，骨髓瘤细胞miRNA-21表达显著高于正常对照浆细胞的表达水平，对骨髓瘤的预后有预测价值[14]。

当前对于多发性骨髓瘤的诊断与预后预测主要依赖于影像学检查、骨髓活检、常规生化指标检查与血清β2-MG检测，但是都存在一定的不足与缺陷。miRNA分子具有良好的稳定性、组织特异性和显著的肿瘤相关性，还具有技术快速、获取简便、创伤小等优点。miRNA-21为1种促癌因子，其可能的靶基因包括程序性细胞死亡因子4、磷酸酯酶-张力蛋白同源物、原肌球蛋白，抑制miRNA-21的表达可以增加化疗药物对肿瘤细胞的生长的抑制作用[15]。还有研究显示miRNA-21高表达能显著上调细胞周期的Cyclin D表达，激活PI3K-Akt信号转导通路，促进G1期向S期转换，从而导致肿瘤细胞异常增殖[16-17]。本研究显示MM组患者随访至今(2020年3月1日)，平均随访时间(32.72±2.28)个月，死亡18例，死亡率为29.0%；直线相关分析显示多发性骨髓瘤患者的预后死亡与miRNA-21、β2-MG、IgA、临床分期成正相关性(P<0.05)，与ALB、LDH、Hb成负相关性(P<0.05)。表明miRNA-21可参与多发性骨髓瘤的发生、发展过程，调节机体内环境的变化，从而影响患者的预后。

多发性骨髓瘤患者中位生存时间约为3年，多数患者对化疗药物还是比较敏感，但是也有部分患者可出现耐药和临床复发[18-19]。探究多发性骨髓瘤的恶性进展和转移的分子机制，寻找新的治疗靶点，对改善患者预后具有重要意义。本研究显示COX回归分析显示miRNA-21、临床分期、β2-MG、Hb、ALB等影响多发性骨髓瘤患者预后死亡的主要因素(P<0.05)。从机制上分析，miRNA-21对编码基因的表达具有调控作用，可影响细胞的分化、增殖及凋亡，从而影响多发性骨髓瘤的预后[20-21]。不过miRNAs在多发性骨髓瘤中的作用有一定的复杂性，在某种意义上从临床组织得到的多发性骨髓瘤骨髓组织标本无法真实反映出miRNAs的表达谱。再者限于患者数量少及收集标本时间较短的原因，本次研究只纳入了较少的病例，可能存在一定的研究偏倚，将在下一步进行深入分析。

表2 前列腺癌患者预后死亡与miRNA-21等指标的相关性

表3 影响多发性骨髓瘤患者预后死亡的因素

总之，miRNA-21在多发性骨髓瘤患者骨髓中呈现高表达状况，与患者的血液学指标显著相关，可影响与预测患者的预后。