MiR-425-5p通过调控PTEN促进乳腺癌细胞体外生长和转移的机制

张杨蕊 庞 霞 黄 培 薛金慧

乳腺癌(breast cancer，BC)是多发病于女性的恶性肿瘤，且发病率呈增长趋势[1]。目前乳腺癌的主要治疗方法为外科手术，但是术后肿瘤转移、肿瘤耐药、预后差等问题仍然是乳腺癌治疗的难题[2]。已有研究表明[3]，特异性的分子靶向治疗能够有效提高恶性肿瘤治疗效果以及改善患者预后，但是对于乳腺癌的分子靶向治疗的研究尚不全面。

MicroRNA(miRNA)是一类长度为21～23个核苷酸的小RNA，成熟的miRNA可被整合到RNA诱导的沉默复合物中，并且以不完全互补的方式与靶mRNA的3'非翻译区(3'UTR)中的特定位点结合，以介导RNA的降解或抑制RNA的蛋白质的翻译[4]。已有研究表明，miRNA在肿瘤组织中差异表达，介导肿瘤的发生发展，例如，在肾细胞癌中，miR-425-5p的表达上调并促进肿瘤细胞活力、侵袭和迁移[5]；在前列腺癌中，高miR-425-5p表达可显著促进肿瘤细胞增殖，迁移和侵袭[6]。但是，miR-425-5p在乳腺癌中的作用仍然未知。本研究探究了miR-425-5p对乳腺癌细胞的作用，旨在为乳腺癌的分子治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺上皮细胞MCF10A(中国科学院上海生命科学研究所)；乳腺癌细胞株MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-20(中国科学院上海生命科学研究所)；miR-425-5p mimic、miR-425-5p mimic NC、miR-425-5p inhibitor、miR-425-5p inhibitor NC(苏州吉玛基因股份有限公司)；RNA转染试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)；PTEN小干扰RNA(siPTEN)(苏州吉玛基因股份有限公司)；PTEN质粒(汉恒生物技术有限公司)；MTT检测试剂盒、细胞凋亡试剂盒(沈阳万类生物技术有限公司)；PTEN抗体、山羊抗兔二抗(沈阳万类生物技术有限公司)，RT-qPCR检测试剂盒(沈阳万类生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取液氮保存的MCF10A、MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-20细胞，于37 ℃水浴锅中快速解冻，加入等体积的含10%胎牛血清的DMEM完全培养基稀释，1 000 rpm离心5 min，然后将细胞重悬，转移至培养皿中，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养至细胞汇合率达80%时进行传代。

1.2.2 RT-qPCR检测乳腺癌细胞中miR-425-5p的表达水平 取对数生长期的乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞至离心管中，加入Trizol裂解5 min，将200 μl氯仿加入上述裂解液，静置5 min，12000×g，4 ℃离心15 min，取上层溶液，加入500 μl异丙醇，12000×g，4 ℃离心10 min，弃上清，1 ml 75%乙醇清洗RNA沉淀后，20 μl RNA-free水重悬RNA沉淀，55 ℃水浴10 min，即为总RNA，使用核酸定量仪检测总RNA含量。根据miRNA cDNA Synthesis 试剂盒指示配置反应体系，将提取的RNA逆转为cDNA，然后利用核酸定量仪对cDNA进行定量。然后根据EvaGreen miRNA qPCR试剂盒指示配置反应体系，进行qPCR反应，采用GAPDH作为内参，反应后采用2-ΔΔCt法计算miR-425-5p的表达量。

1.2.3 细胞转染 取对数生长期的乳腺癌细胞接种于6孔板中，按照RNA转染试剂盒说明书，取3 μg的RNA用不含血清及双抗的DMEM稀释至100 μl，然后加入5 μl的RNA转染试剂，静置20 min后，稀释至1 ml，并用上述混合液培养乳腺癌细胞8 h，然后更换为含有10%胎牛血清的完全培养基培养24 h。根据脂质体2000转染试剂说明书，将对数生长期的乳腺癌细胞接种至6孔板中，细胞生长至70%时，按说明书进行转染PTEN质粒。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖 将乳腺癌细胞调整至50000个/ml，将上述细胞接种至96孔板，每孔100 μl，每组3个复孔，并将细胞培养2～4 h，使乳腺癌细胞完全贴壁，然后每孔加入10 μl的CCK-8溶液，继续37 ℃培养，分别于24 h、48 h、72 h用酶标仪检测各孔450 nm处的吸光度，OD值越大，细胞增殖能力越强。

1.2.5 Transwell小室法检测细胞迁移 调整细胞至5×104个/ml，并取200 μl细胞接种至Transwell小室中，每组3个复孔，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μl完全培养基，使小室底部浸入培养基，将24孔板于培养箱中培养24 h后，取出小室用PBS清洗，小室底部用无水乙醇固定30 min，晾干后用结晶紫对小室底部染色10 min，清洗晾干后，在显微镜下观察拍照，每孔拍5张照片，并用Photoshop软件计数，比较各组迁移的细胞数目，细胞数目越多，细胞迁移能力越强。

1.2.6 荧光素酶报告实验验证靶基因 使用miRDB和microT-CD 2个数据库筛选miR-425-5p的靶基因，取2个数据库中的靶基因的交集，并使用Targetscan软件根据数据库提供的信息对靶基因进行置信水平分析，取置信水平最高的靶基因。构建GLS1野生型(pGL3-PTEN WT组)、突变型质粒(pGL3-PTEN MUT组)以及空白质粒(pGL3-control组)，并使用脂质体2000转染试剂将上述质粒转染进293T细胞，再用RNA转染试剂将miR-425-5p mimic和miR-425-5p mimic NC转染至上述293T细胞，按照双荧光素酶报告实验检测试剂盒检测荧光素酶反应强度。

1.2.7 Western blot检测乳腺癌细胞中PTEN表达水平 取各组细胞加入125 μl的RIPA蛋白裂解液和5 μl的PMSF蛋白酶抑制剂，裂解30 min后，12000×r，4 ℃离心10 min，取上清，即为总蛋白。BCA蛋白定量后蛋白沸水浴加热变性，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用5%的脱脂牛奶对PVDF膜封闭2 h，然后以1∶1000比例稀释后的PTEN、GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗室温孵育12 h，再用TBST洗膜后按照ECL试剂盒说明书配置发光液，并将PVDF膜浸入发光液中反应30 s，曝光并拍照，用Image J软件对曝光结果进行定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 MiR-425-5p在乳腺癌细胞株中的表达情况

RT-qPCR检测结果显示，乳腺癌细胞株MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-20中miR-425-5p表达水平均显著高于乳腺上皮细胞MCF10A(P<0.05)，见图1；提示乳腺癌细胞通过高表达miR-425-5p促进乳腺癌的发生发展。

注：与MCF10A相比，*P<0.05；*** P<0.001。

2.2 MiR-425-5p对乳腺癌细胞增殖能力的影响

CCK-8检测结果(图2)显示，相比于转染MiR-NC组，转染miR-425-5p mimic组的MCF-7细胞增殖能力显著增加(P<0.05)，而转染miR-425-5p inhibitor组的MDA-MB-231细胞增殖能力显著下降，提示过表达miR-425-5p可促进乳腺癌增殖能力。

2.3 MiR-425-5p对乳腺癌细胞迁移能力的影响

细胞迁移检测结果(图3)显示，相比于miR-NC组，转染miR-425-5p mimic组的MCF-7细胞迁移能力显著增加(P<0.001)，而转染miR-425-5p inhibitor组的MDA-MB-231细胞迁移能力显著下降，说明miR-425-5p能够显著促进乳腺癌细胞的迁移能力。

2.4 MiR-425-5p能够靶向结合PTEN

数据库筛选结果显示PTEN为miR-425-5p的靶基因，其靶向结合位点如图4所示。双荧光素酶实验验证PTEN与miR-425-5p靶向关系结果显示(图5)，miR-425-5p mimic能够使pGL3-PTEN WT组细胞荧光强度显著下降(P<0.001)，而pGL3-Control组和pGL3-PTEN MUT组细胞荧光强度无显著变化，说明PTEN为miR-425-5p的靶基因。

2.5 MiR-425-5p对PTEN蛋白水平表达的影响

Western blot检测结果(图6)显示，在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，转染miR-425-5p mimic后PTEN表达显著下调(P<0.001)，转染miR-425-5p inhibitor后PTEN表达显著上调(P<0.001)，说明miR-425-5p可抑制抑癌基因PTEN的表达，进而影响了乳腺癌细胞的生长和转移。

2.6 MiR-425-5p靶向PTEN促进乳腺癌细胞增殖能力

CCK-8检测结果(图7)显示，miR-425-5p mimic能够显著促进MCF-7增殖能力(P<0.01)，而转染PTEN过表达质粒后其增殖能力显著低于miR-425-5p mimic组(P<0.05)，与对照组无显著性差异(P>0.05)；miR-425-5p inhibitor能够显著抑制MDA-MB-231增殖能力(P<0.01)，而转染siPTEN抑制PTEN表达后细胞增殖能力显著增加(P<0.05)，提示miR-425-5p能够抑制PTEN的表达而提高乳腺癌细胞的增殖能力。

2.7 MiR-425-5p靶向PTEN促进乳腺癌细胞迁移能力

细胞迁移实验检测结果(图8)显示，miR-425-5p mimic显著促进MCF-7迁移(P<0.001)，过表达PTEN后MCF-7迁移能力显著下调(P<0.001)；转染miR-425-5p inhibitor显著抑制MDA-MB-231迁移能力(P<0.01)，而抑制PTEN表达后细胞迁移显著增加(P<0.05)，提示miR-425-5p能够抑制PTEN的表达而促进乳腺癌细胞的体外转移能力。

注：与MiR-NC相比，*P<0.05；** P<0.01；*** P<0.001。

注：与MiR-NC相比，*** P<0.001。

图4 miR-425-5p与PTEN结合区域预测结果及结合区域突变结果

注：与miR-NC组相比，***表示P<0.001。

注：与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 讨论

根据2015年国家癌症中心统计结果，我国乳腺癌的发病率和死亡率均呈上升趋势，且逐渐趋于年轻化，国家癌症研究机构预计，截至2030年，乳腺癌的死亡率将上升至47.94%[7-8]。已有研究表明，术后复发、肿瘤转移、肿瘤耐药等均是导致乳腺癌高死亡率的原因，因此探究乳腺癌生长和转移的机制对于乳腺癌的临床治疗至关重要。

随着精准医疗和分子诊断的发展，越来越多的研究将肿瘤的治疗集中在基因水平，其中miRNA在调控肿瘤生长和转移的过程中发挥重要的作用，研究表明人类基因组中约有三分之一的基因受miRNA的调控，其作用机制主要是通过结合mRNA3'-UTR而抑制靶基因的表达，在基因的表达中起到负调控的作用，肿瘤组织miRNA的差异表达是调控肿瘤增殖、迁移、凋亡等生物学进程的重要因素[9-10]，例如[11]，miR-1299在三阴性乳腺癌中高表达而促进肿瘤的增殖和迁移能力，miRNA-621调控乳腺癌的化疗耐药，而本研究发现miR-425-5p在5种乳腺癌细胞中均高表达，提示miR-425-5p作为差异表达的miRNA或可影响乳腺癌的发生发展。

注：与NC相比，** P<0.01；*** P<0.001；与miR-425-5p mimic组相比，# P<0.05，### P<0.001；与miR-425-5p inhibitor组相比，a P<0.05，aaP<0.001。

注：与NC相比，*** P<0.001；与miR-425-5p mimic组相比，### P<0.001；与miR-425-5p inhibitor组相比，aaaP<0.001。

本研究发现，在miR-425-5p表达量较低的乳腺癌细胞株MCF-7中，转染miR-425-5p mimic 过表达miR-425-5p后MCF-7的增殖能力和迁移能力显著增加；而在miR-425-5p表达较高的MDA-MB-231细胞中转染miR-425-5p inhibitor抑制miR-425-5p表达后MDA-MB-231的增殖能力和迁移能力显著降低，说明miR-425-5p对乳腺癌的生长和转移均有显著影响，或可作为乳腺癌治疗或诊断的生物标志物。

PTEN是抑癌基因家族中的一员，具有磷酸酯酶的活性，PTEN蛋白可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制肿瘤的发生发展[12]。研究表明，将野生型PTEN基因转染到该基因异常的胶质母细胞瘤后，肿瘤细胞的生长、侵袭能力受到明显抑制，发现其对肿瘤细胞的酪氨酸激酶FAK的活性有明显的抑制作用。此外，PTEN蛋白还可通过特异性地使IP3的第三位磷酸去磷酸化而间接地抑制胰岛素诱导的磷酸肌醇-3激酶的活性，进而调控细胞的生长[13-14]。

本研究通过数据可预测到PTEN可能为miR-425-5p的靶基因，并通过双荧光素酶报告实验验证了PTEN和miR-425-5p的靶向关系，并且发现转染miR-425-5p mimic的乳腺癌细胞PTEN表达显著下调，而转染miR-425-5p inhibitor的乳腺癌细胞PTEN表达显著上调，而已有研究表明PTEN可调控肿瘤的生长和转移，所以提示miR-425-5p或可通过抑制PTEN的表达而调控乳腺癌的生长和转移，实验结果表明，在MCF-7中转染质粒过表达PTEN后，miR-425-5p mimic的促增殖和迁移作用则被逆转；MDA-MB-231中抑制PTEN表达后，miR-425-5p inhibitor的抑制增殖和迁移作用亦被逆转，说明PTEN作为miR-425-5p的下游靶基因调控乳腺癌发生发展。

综上所述，miR-425-5p能够调控乳腺癌细胞的体外生长和转移，其机制可能为抑制抑癌基因PTEN的表达。