miR-145介导TGF-β/Smad信号通路对乳腺癌患者治疗及预后的影响

杨 斌 汪嫣嫣 甘家兵

乳腺癌在女性中具有较高的发病率以及病死率[1]，发病机制与遗传、环境、病毒等因素有关[2]，主要通过根治术进行治疗[3]，但由于肿瘤的转移能力，此病极易复发[4]。miRNA是非编码小分子RNA中的一员，具有高度的保守性、特异性以及差异性，对细胞的生长增殖凋亡具有一定的调控作用[5-6]。而TGF-β/Smad信号通路对于肿瘤的发生进展也有一定的调节作用[7]。本研究通过检测miR-145以及TGF-β/Smad信号通路中的相关蛋白，并探讨其对乳腺癌治疗及预后的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料

将我院2016年6月至2019年10月治疗的114例乳腺癌患者纳入研究，患者平均年龄在(49.29±6.16)岁。TNM分期：Ⅰ期患者35例，Ⅱ～Ⅲ期49例，Ⅳ期30例。导管癌有51例，小叶癌有31例，湿疹样癌有32例。各分期患者年龄、性别等基本资料之间没有统计学差异(P>0.05)。纳入标准:①病理学检查确定其为乳腺癌；②符合WHO乳腺癌分类标准；③无肿瘤病史者；④获得患者及其亲属的认同。排除标准：①严重脏器功能不全患者；②有其他恶性肿瘤并发患者；③已治疗患者；④无完整临床资料者。本研究经我院的伦理委员会审核通过。所有患者均行乳腺癌根治术治疗，手术中留取癌组织，手术后根据患者治疗情况适当进行放化疗。

1.2 RT-PCR检测miR-145的表达

检测手术中留存的癌组织以及癌旁组织标本，依照试剂盒(北京原平皓生物，HF104-01)说明书通过Trizol的方法对总RNA进行提取、定量，依循逆转录试剂盒(Qiagen，205111)步骤合成cDNA，后依RT-PCR试剂盒(Transcriptor cDNA Synth.Kit 2，上海臻诺生物科技)指导检测miR-145的表达，以U6为内参，最后通过2-△△Ct公式获得结果。

1.3 Western blot检测TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达

消化、离心获得的能够稳定表达miR-145的癌组织，SDS-PAGE电泳获得相关蛋白，冷冻保存，加入PBST稀释的一抗，泡入PVDF膜后于4 ℃条件下孵育12 h，转膜后加入二抗，室温下孵育2 h，洗脱，显色，成像，Image J软件分析，从而获得相关蛋白的表达情况。

1.4 随访

对患者按照前两年三个月一次，后一年六个月一次的时间段进行随访，方式分为电话、门诊等，对患者的术后症状、治疗、生存情况等进行记录，随访结束点为日期截止或患者失访、死亡。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 miR-145的表达情况

对患者miR-145的表达进行检测，癌旁组织、Ⅰ期乳腺癌组织、Ⅱ～Ⅲ期乳腺癌组织及Ⅳ期乳腺癌组织的相对表达量分别为(5.28±1.03)、(4.91±0.71)、(4.02±0.65)及(3.19±0.33)，差异具有统计学意义(F=16.273，P<0.05)。与癌旁组织相比，治疗前Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期以及Ⅳ期乳腺癌组织中miR-145的表达降低，并且其表达水平随着TNM分期的上升而有所下降(P<0.05)。

2.2 TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达

将治疗前后各组织中的相关蛋白进行对比，与癌旁组织相比，Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期以及Ⅳ期乳腺癌组织中TGF-β1、Smad3、Gli2以及Vimentin的表达均有所上升(P<0.05)，且随着TNM分期的上升而上升(P<0.05)。结果见图1、表1。

图1 TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达

2.3 miR-145与TGF-β/Smad信号通路的关系

将miR-145与TGF-β/Smad信号通路的相关蛋白行相关性分析，miR-145与TGF-β1、Smad3、Gli2、Vimentin呈负相关(P<0.05)。结果见表2。

2.4 miR-145的水平与乳腺癌患者临床病理特征的关系

如表3所示，miR-145的水平与淋巴结转移、TNM分期以及增殖指数有关(P<0.05)，而与年龄、绝经、病理类型、肿瘤大小、ER、PR以及HER-2无关(P>0.05)。

表1 TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达

表2 miR-145与TGF-β/Smad信号通路的关系

表3 miR-145的水平与乳腺癌患者临床病理特征的关系

2.5 乳腺癌患者生存影响因素的COX回归分析

如表4所示，通过回归分析，得出淋巴结转移、TNM分期、miR-145、TGF-β1、Smad3、Gli2以及Vimentin是乳腺癌患者生存的独立危险因素。

表4 乳腺癌的生存因素分析

2.6 miR-145及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白与预后的关系

以乳腺癌患者miR-145、TGF-β1、Smad3中位数为界分为miR-145高表达、miR-145低表达与TGF-β1高表达、TGF-β1低表达及Smad3高表达、Smad3低表达。Kaplan-Meier法行生存率分析发现，miR-145高表达组的总生存率要高于低表达组的生存率(P<0.05)，TGF-β1、Smad3低表达的总生存率比高表达组的生存率高(P<0.05)。见图2。

3 讨论

作为女性中常见的恶性肿瘤，乳腺癌发病率逐步上升[8]，原位乳腺癌虽不致命，但随着乳腺癌细胞在重要器官中的转移，会对患者的正常组织有所破坏，从而威胁患者生命[9-10]。临床上多使用根治性手术联合化学治疗[11]，但由于其复发以及转移，此疾病通常具有不良的预后效果[12]，因而对其相关机制以及影响因素进行探讨至关重要。

有研究显示，乳腺癌与遗传、病毒等因素有关[13]，因而越来越多的研究者对miRNA在肿瘤中的作用进行研究。miRNA是1种极小的非编码RNA，极度保守、特异[14]，可以通过对靶mRNA的转录后翻译过程进行降解和抑制，来对有关基因的表达进行调控，发挥有关生物学功能，参与机体的病理生理过程[15]。余杰等[16]对已有一定了解的miR-31-5p进行研究，探究其在乳腺癌细胞中的有关机制，他们通过对该细胞的培养、转染，检测其中miR-31-5p的表达，检测细胞的增殖、凋亡以及相关蛋白的表达情况，最终得出miR-31-5p可调控乳腺癌的放化疗情况，其过表达对乳腺癌的放化疗具有促进作用；又如任晖等[17]通过检测miR-124的表达，细胞侵袭、增殖的情况以及双荧光素酶鉴定miR-124与SP1的关系，了解到miR-124的过表达可通过调控SP1来抑制乳腺癌的进展。除此之外，miR-367、miR-130a-3p、miR-221等对乳腺癌也均有一定的调控作用。

图2 乳腺癌患者的生存率比较

本研究对我院2016年6月至2019年10月治疗的114例乳腺癌患者进行研究，对所有患者手术化疗治疗前后的癌组织、癌旁组织标本进行检测。miR-145处于染色体9q31上，对于肿瘤进展具有抑制作用[18]，RT-PCR检测miR-145的表达发现，治疗前Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期以及Ⅳ期乳腺癌组织中miR-145的表达与癌旁组织相比均降低，并且随着TNM分期的上升其表达水平有所下降(P<0.05)，这一结果提示乳腺癌中miR-145呈现低表达的趋势，miR-145的水平可能预示着乳腺癌患者的病情程度。有研究表明，TGF-β/Smad信号通路与机体的生长发育、人体肿瘤的发生进展具有息息相关的作用，TGF-β1是人体内TGF-β的主要存在形式，对于Smad以及癌基因突变具有一定的诱导作用，从而促进肿瘤细胞的侵袭迁移[19]。进而经WB检测TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达后发现，Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期以及Ⅳ期乳腺癌组织中TGF-β1、Smad3、Gli2以及Vimentin的表达与癌旁组织相比均有所上升(P<0.05)，且随着TNM分期的上升而上升，提示着TGF-β/Smad通路对乳腺癌的增殖具有一定的促进诱导作用。相关性分析发现，miR-145与TGF-β1、Smad3、Gli2、Vimentin呈负相关(P<0.05)，提示miR-145可能下调TGF-β/Smad信号通路。而将miR-145的水平与乳腺癌患者临床病理特征施以相关性分析发现，miR-145的水平与淋巴结转移、TNM分期以及增值指数有关(P<0.05)。进一步使用COX回归分析以及Kaplan-Meier法行生存率分析得出，淋巴结转移、TNM分期、miR-145、TGF-β1、Smad3、Gli2以及Vimentin是乳腺癌患者生存的独立危险因素。miR-145高表达组的总生存率要比低表达组的生存率高(P<0.05)，TGF-β1、Smad3低表达的总生存率要比高表达组的生存率高(P<0.05)。表明高表达的miR-145及低表达的TGF-β1、Smad3对患者具有较好的预后效果。

综上，miR-145在乳腺癌患者中呈低表达，TGF-β/Smad信号通路则呈高表达。临床可能通过下调TGF-β/Smad信号通路使患者预后效果达到较佳。