卵原干细胞的研究进展

李树斌，刘 刚，戴雁峰

（内蒙古大学 生命科学学院，呼和浩特 010020）

哺乳动物大多数组织中存在干细胞，干细胞因具有自我更新及分化潜能通常参与器官组织的修复和重建。哺乳动物的睾丸存在精原干细胞（spermatogenic stem cells，SSCs），精原干细胞源源不断地分化形成精子，维持雄性哺乳动物一生的精子发生。几十年来，传统生殖生物学观点认为哺乳动物一出生，其卵巢含有数量一定的原始卵泡，随着卵巢的发育，卵母细胞经历排卵、凋亡，数量不断减少直至消耗殆尽。然而，在2004年J.Johnson等［1］首次发现卵巢中存在有丝分裂活性的生殖干细胞，这一发现挑战了长达半个世纪的雌性哺乳动物配子发生学说。2009年Zou K.等［2］利用抗原抗体特异反应筛选表达Ddx4蛋白细胞，从小鼠卵巢内分离获得了卵原干细胞（OSCs），这些细胞可以在体外持续增殖，表达生殖干细胞标志蛋白Ddx4、Oct4、Stella、Prdm1等，将体外培养的OSCs移植到免疫缺陷的雌性小鼠卵巢中，OSCs可在体内卵巢分化形成卵母细胞，这一发现将OSCs的研究推向一个新阶段。

1 卵子的产生

1.1 卵原细胞的产生

关于哺乳动物生殖细胞发生机制的研究主要集中于小鼠。小鼠的原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）来源于上胚层（epiplast）细胞［3－4］。胚胎发育至6.5 dpc时，在上胚层细胞分泌的BMP4等生长因子的作用下，PGCs前体细胞由上胚层后部迁移至尿囊基底部［3－4］，在尿囊基底部分化形成PGCs，PGCs通过重编程，开始表达PGCs特异化的转录因子Prdm1和Prdm14［5－6］。当胚胎发育至10.5～11.5 dpc，PGCs通过后肠迁移至生殖嵴［7］。在这个迁移过程中，PGCs开始表达多能干细胞转录因子，基因组DNA去甲基化［5］，X染色体再次被激活，同时组蛋白的修饰也发生显著变化。PGCs迁移到达生殖嵴后，PGCs开始下调多能干细胞转录因子的表达水平，PGCs逐渐分化形成胚胎生殖干细胞（embryonic germ cells，EGCs）［8］。

1.2 原始卵泡的形成

EGCs在生殖嵴内通过有丝分裂进行有限的细胞增殖，通常增殖发生在胚胎发育的13.5～15.5 dpc，这些细胞在细胞分裂时发生不完全细胞分裂，细胞间通过桥状结构相连接（intercellular bridge），由细胞间桥相连的细胞团聚合成簇，形成生殖细胞巢（germ cell nest）［9］。生殖细胞巢外面由卵巢索细胞包围，生殖细胞巢内的细胞称之为卵原细胞［10］。生殖细胞巢内细胞间可通过连接的桥状结构进行大分子输送［11］，使某些卵原细胞获得发育的特权［12］，卵原细胞也可能通过间桥连接进行减数分裂细胞周期的同期化［13］。

在脊椎动物，形成生殖细胞巢是生殖细胞发生的普遍现象［13］。但是除了对果蝇生殖细胞巢的形成和破裂有较多的研究外，目前人们对哺乳动物生殖细胞巢的形成和功能了解甚少。最近的研究发现，生殖细胞通过Dazl调控Tex14 mRNA的翻译，控制生殖细胞巢内细胞间桥的断裂［14］。Tex14是构成生殖巢细胞间桥的蛋白之一，在睾丸中Tex14 mRNA与Dazl蛋白共沉淀，Dazl通过与Tex14 mRNA的3′UTR结合，调控Tex14的翻译。生殖细胞表达Dazl是获得应答视黄酸（retinoic acid，RA）从而进入减数分裂的关键蛋白，抑制Dazl的表达可阻止生殖细胞进入减数分裂。因此，Dazl－Tex14将生殖细胞巢内细胞间桥断裂与减数分裂两个不同细胞活动连接起来。生殖细胞巢内细胞间桥断裂是形成原始卵泡的先决条件。原始卵泡形成时发生三个不同的细胞生物学现象：（1）生殖巢内细胞间桥断裂。大约有2／3的卵原细胞通过凋亡／自嗜（apoptosis／autophage）死亡［15－16］，只有1／3的卵原细胞能够与前体颗粒细胞形成原始卵泡［17］。（2）卵原细胞进入减数分裂，并停滞在减数分裂的前期，形成初级卵母细胞［18］。（3）生殖细胞巢外周的前体颗粒细胞侵入生殖细胞巢［10］，包围一些优势卵原细胞，形成原始卵泡，阻止了卵母细胞退化，使初级卵母细胞的减数分裂停滞在减数分裂前期。

颗粒细胞前体细胞是分化形成卵泡颗粒细胞的前体细胞，在形成生殖细胞巢时颗粒细胞前体细胞位于生殖细胞巢外周［9］，当生殖细胞巢被激活、细胞间桥断裂时，颗粒细胞前体细胞发生迁移，侵入生殖细胞巢。颗粒细胞前体细胞呈扁平状，通常每个原始卵泡由10个左右扁平的前体细胞包围。在小鼠出生前位于卵巢髓质和皮质的原始卵泡是由表达不同标记蛋白的颗粒细胞前体细胞构成［19］。髓质的原始卵泡前体颗粒细胞来源于髓质表达Foxl2基因［20］，而皮质的原始卵泡是由表达Lgr5基因的颗粒细胞前体细胞构成，在形成原始卵泡时它们由近表皮内迁至深皮质部［21］。两类不同部位和细胞组成的原始卵泡在卵泡发生时间和速度上不同［19，22－23］，绝大多数位于髓质部的原始卵泡从出生就开始生长，而皮质部卵泡发生开始于初情期前后，供应动物生殖周期所需要的全部卵泡［19，22］。

1.3 卵母细胞的减数分裂

视黄酸（RA）是诱导生殖细胞进入减数分裂的关键化学物质［24］。RA通过诱导生殖细胞表达Stra8诱导生殖细胞进入减数分裂［25－27］。敲除Stra8基因，卵巢上的生殖细胞既不进行减数分裂，也不表达与减数分裂相关的基因［26，28］。在性别分化后PGC分化形成EGCs，开始表达Dazl［29］，Dazl蛋白是在生殖细胞特异表达的RNA结合蛋白［30］，敲除Dazl基因的小鼠EGCs细胞丧失产生配子的潜能。生殖细胞表达Dazl是RA诱导Stra8表达进行减数分裂的先决条件［29，31－33］。由此可见，Dazl是生殖细胞获得减数分裂潜能的关键分子。DMRT1（doublesex and mab－3 related transcription factor）是参与减数分裂调节的一个基因［34］。在雄性和雌性生殖细胞中DMRT1表现不同的生物功能［35－36］，在DMRT1敲除的雌性小鼠生殖细胞中，Stra8的表达水平下降，卵巢上的卵泡数减少［36］。RA通过与细胞核内的RA受体（RAR）结合发挥其生物学功能。在Stra8基因的启动子有两个潜在的RAREs结合域，RA可能与RAR／RXR异二聚体形成复合体，并与RAREs结合，直接调节Stra8的表达［37－38］。

2 OSCs

2.1 OSCs的发现

无脊椎动物（如果蝇）及低等脊椎动物（如鱼、鸟）的卵巢中有OSCs，这些OSCs可以通过有丝分裂进行自我复制，同时周期性或不间断地分化产生新的卵母细胞，维持体内原始卵泡的数量。哺乳动物出生后，卵巢中原始卵泡的数量一定，随着生殖周期的进行，卵巢中卵泡数量不断减少，直至消耗完为止，而卵巢不再产生新的卵母细胞［39］。但是过去几年，哺乳动物卵原干细胞研究挑战了这个传统生殖生物学观点。

2004年J.Johnson等［1］对小鼠卵巢中是否存在OSCs进行研究并得出以下三点结论：（1）雌性小鼠在产后16～40 d内原始卵泡共减少了294个。M.J.Faddy等［40］的研究表明，在产后14～42 d原始卵泡库由于卵泡闭锁及生长激活，到初级卵泡阶段每天平均应减少89个原始卵泡。据此推算在J.Johnson等［1］的研究中，产后16～40 d期间原始卵泡共应减少2 136个。但这与J.Johnson等［1］的试验结果差异较大。因此，推测在小鼠卵巢中存在某种干细胞，它会分化形成卵母细胞用以补充原始卵泡库。（2）在青年及成年雌性小鼠卵巢中具有同时表达Brdu及Ddx4的细胞，证明卵巢中存在具有有丝分裂活性的生殖细胞。（3）将带有GFP标记的小鼠卵巢组织切半后移植到切掉一半卵巢组织的GFP阴性SCID小鼠卵巢包膜内，4周后发现，部分GFP阳性卵巢组织及部分GFP阴性卵巢组织中均可发现由GFP标记的卵母细胞、不带GFP标记的颗粒细胞包裹形成的重组卵泡，以及由不带GFP标记的卵母细胞与带有GFP标记的颗粒细胞组合形成的重组卵泡。该结果进一步说明小鼠卵巢中具有可迁移的生殖细胞且可支持卵泡发生。根据以上三点，推测小鼠卵巢中存在既可以进行有丝分裂又可以分化形成卵子的细胞，该研究引发了生殖生物学领域对于雌性哺乳动物卵巢中是否具有OSCs的研究热潮。

2005年，J.Johnson等［41］研究发现了在小鼠骨髓外周血细胞表达生殖细胞的标志蛋白，将带有GFP标记的骨髓外周血细胞通过尾静脉注射到SCID小鼠体内后，发现在受体小鼠的卵巢中存在带有GFP标记的卵母细胞生成。推测在骨髓外周血中存在具有分化形成卵母细胞能力的干细胞。但这个结论在2006年遭到一些学者的质疑，通过外科手术将GFP转基因小鼠与野生型小鼠的脉管系统相连，制备并联体小鼠，小鼠并联一段时间后观察卵子发生，结果表明，带有GFP标记的骨髓细胞或其他血液循环细胞可以进入野生型小鼠的血液循环系统；但是野生型小鼠的卵巢中却没有GFP标记的卵母细胞。这说明骨髓外周血中的细胞并不能够分化形成卵母细胞［42］。但骨髓造血干细胞确实有助于卵巢功能的恢复。研究表明，患有范科尼贫血症的妇女在进行了骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）后成功怀孕［43－44］。但研究者并未检测到由供体骨髓细胞形成的生殖细胞。因此推测，BMT可以促进由不完全卵泡耗竭引起的卵巢功能衰竭后卵巢功能的恢复，但骨髓外周血中的细胞并不能转化为卵母细胞。

2009年，Zou K.等［2］利用羧基端Ddx4蛋白抗体进行磁珠分选（magnetic cell sorting，MACS），首次从出生5 d后的小鼠卵巢中分离获得OSCs，在体外长期培养后OSCs始终表达生殖干细胞标志基因Oct4、Ddx4、Ifitm3（Fragillis）、Dppa3、Rex1、Dazl和Blimp－1等；将长期培养后的OSCs注射到小鼠卵巢，可以得到由该细胞系产生的健康子代小鼠。

研究表明，使用荧光激活分选（Fluorescence activated cell sorting，FACS）方法从处于育龄阶段的女性卵巢中分离得到了Ddx4阳性的细胞，该细胞经过长期培养可在体外建系，将该细胞与人卵巢上皮共同注射移植到SCID小鼠卵巢中，可在受体小鼠卵巢中检测到由该细胞分化形成的卵母细胞［45］。

2.2 OSCs的研究争议

关于OSCs的研究仍在许多争议，这些争议主要集中在以下几个方面。

2.2.1 使用Ddx4蛋白抗体分选OSCs的有效性

目前在大多数研究中使用的用于分离、纯化OSCs的特异蛋白Ddx4是已知的在细胞质内表达的蛋白。Ddx4是生殖细胞特异性表达的RNA解旋酶，含有一个DEADc ATP水解结构域和一个HELICc RNA结合结构域，这是所有DEAD盒蛋白家族成员的共同特征［46］。而RNA结合蛋白是胞质蛋白，不是膜结合蛋白。2012年，Zhang H.等［47］研究了卵巢Ddx4阳性细胞在体内外的增殖分化情况，活体成像监测发现，在72 h内小鼠睾丸中Ddx4阳性细胞平均分裂3次，而在卵巢中并没有监测到Ddx4阳性细胞的分裂。同时利用Zou K.等［2］报道的体外培养条件培养Ddx4阳性细胞，培养数天后阳性细胞死亡；在培养Ddx4阴性的卵巢细胞时，可形成类似于人OSCs体外培养形成的扁平状细胞克隆，该克隆可传代到10代以上，但是这些细胞并不表达Sox2、Oct4、Dppa3及Ddx4等基因；将其移植回受体小鼠的卵巢内，也不能分化成卵母细胞。因此Ddx4作为分选OSCs抗体的有效性有待进一步探索。

虽然Zou K.等［48］进一步筛选了三个用于分离OSCs的特异蛋白，包括黏附分子STPB－C（shorttype pituitary gland and brain－cadherin，STPBC）、用于纯化SSCs的膜蛋白CD90以及干扰素诱导跨膜蛋白3（interferon inducible transmembrane proteins 3，Ifitm3，也称为Fragilis），发现使用Ifitm3抗体来分选纯化OSCs的效率比使用Ddx4抗体更高。但是Ifitm3在小鼠中多个组织、器官中均有表达，在肝脏中表达量最高，在睾丸中表达量较低，并不是生殖细胞特异性标志蛋白，而且Ifitm3在卵巢体细胞中也有表达，因此并不能特异性筛选OSCs。

2.2.2 卵巢中并没有干细胞可以补充原始卵泡库

2014年，Zhang H.等［49］利用Gdf9－Cre×iDTR、Sohlh1－CreERT2×R26R转基因小鼠模型追踪卵子再生的过程，结果表明卵巢中并没有OSCs可补充卵泡库。Gdf9是卵母细胞特异性标志蛋白，在卵母细胞发育的所有阶段均有表达。研究表明Gdf9在小鼠OSCs中并不表达，因此其表达与否可以区分OSCs与卵母细胞。当用白喉毒素（diphtheria toxin，DT）处理后，Gdf9－Cre介导卵母细胞中DT受体（diphtheria toxin receptor，DTR）的表达，导致卵母细胞死亡。在DT处理2周后，可以观察到Gdf9－Cre×iDTR小鼠卵巢中的卵母细胞完全消失。DT处理2个月后，与对照组iDTR小鼠的卵巢相比，Gdf9－Cre×iDTR小鼠卵巢明显变小，并且没有任何卵母细胞或卵泡再生现象。将观察时间延长至DT处理后6个月和12个月后，均没有发现Gdf9－Cre×iDTR小鼠卵巢中有卵母细胞或卵泡再生。因此得出结论：给予DT处理之前小鼠卵巢中存在的初始卵泡库是小鼠卵巢中生殖细胞的唯一来源。

Sohlh1仅在减数分裂阻滞的未成熟卵母细胞中激活表达。将Sohlh1－CreERT2小鼠与Rosa26报告基因小鼠（R26R）杂交，产生子代小鼠Sohlh1－CreERT2×R26R，通过向Sohlh1－Cre-ERT2×R26R小鼠注射他莫昔芬（Tamoxifen）可选择性地标记表达Sohlh1的未成熟卵母细胞。在小鼠产后28天注射Tamoxifen，在第35天观察到小鼠卵巢中表达Sohlh1的未成熟卵母细胞可被β－半乳糖苷酶染成蓝色。作为对照，在妊娠8.5～12.5 dpc这一PGCs形成阶段给孕鼠注射Tamoxifen，在产后2个月子代小鼠卵巢中并没有β－半乳糖苷酶染成蓝色的卵母细胞。这证明Sohlh1－CreERT2×R26R小鼠模型仅特异性地标记已进入减数分裂的未成熟卵母细胞，却并不能标记更早期的PGCs或与之处于相似分化程度的OSCs。因此，如果卵巢中存在OSCs可以补充原始卵泡库，那卵巢中标记的卵母细胞与未被标记的卵母细胞比例应降低。但在该试验中给产后28天小鼠注射Tamoxifen，在2个月及8个月分别取出小鼠左侧卵巢及右侧卵巢，结果表明：在2个月时一些标记的卵母细胞被激活并发育为次级卵母细胞，标记的卵母细胞占总数的百分比为（37.41±5.37）%；在8个月时收集右侧卵巢，标记的卵母细胞占总数的百分比为（37.74±6.55）%，并没有显著减少。这说明小鼠2～8月龄期间并无任何新生的卵母细胞补充卵泡库，小鼠卵巢在出生后即有一个稳定的卵泡库，支持一生的卵母细胞发育。

2.2.3 OSCs的来源仍未确定 关于OSCs来源于何种细胞，目前主要有以下三种观点：（1）OSCs来源于骨髓外周血循环中的某些干细胞。如前所述，大量关于BMT移植回受体小鼠卵巢的试验证明，骨髓外周血的细胞并不能分化形成卵母细胞，因此这一观点已被否定［42］。（2）OSCs来源于卵巢表面上皮（ovary suerface epithelium，OSE）中的极小胚胎样干细胞（very small embryonic－like，VSEL）。覆盖在卵巢表面的OSE细胞由单层立方或扁平上皮细胞组成。研究发现，在OSE中存在OSCs及VSEL两类干细胞，这两类细胞主要差异在于细胞直径及Oct4的表达，VSEL相对静止，大小为3～5μm，Oct4核表达；而OSCs的大小超过8μm，Oct4质表达，具有有丝分裂活性。核表达Oct4对于干细胞处于多能状态至关重要。因此推测VSEL是卵巢中最原始的干细胞，在卵巢受到某种刺激后VSEL可分化形成OSCs［50－51］。（3）OSCs来源于少量具有干细胞特征的PGCs衍生未分化细胞，这些细胞可以保留在出生后的卵巢中，在某些情况下可能恢复减数分裂和分化产生卵子［52］。哺乳动物的精子发生及卵子发生都起源于PGCs，并且部分PGCs经特殊的培养条件培养后具有类似多能干细胞的特性。产前小鼠卵巢中存在未进入减数分裂的PGCs，细胞数目较多，占生殖细胞总数的10%；在产后PGCs可进行有丝分裂，激活卵巢，因此推测OSCs来源于少量未分化的PGCs［52］。并且在整个胚胎发育阶段，PGCs分化形成卵母细胞的过程经历了复杂的全基因组重编程，该过程需要与卵巢的体细胞相互作用。因此，如果OSCs来源于卵巢中其他的体细胞，则需要在成年卵巢环境中经历在胚胎发育过程中建立的生殖系细胞所需的基因及表观遗传的改变，并产生具有正确染色质表观遗传状态的卵母细胞，特别是与全能性和印记基因相关的表观遗传状态，然而这一过程是非常难实现的，因此推测OSCs不可能来源于生殖系以外的其他细胞。

2.3 OSCs的特征

OSCs存在于卵巢表面上皮中，其细胞形态及生长模式与SSCs较为相似，细胞直径为8～10μm，核质比较高。OSCs在体外培养形成串状克隆，类似于PGCs在体外培养时形成的克隆，串状的OSCs分裂后其细胞膜相连，在连接处表达E－cadherin蛋白（也称为Cdh1），该蛋白参与形成串状OSCs克隆的黏着连接［53］。关于果蝇OSCs的研究表明，雌性生殖细胞所必需的E－cadherin蛋白是维持细胞间相互作用和形成细胞微环境所必需的蛋白。在小鼠PGCs体外培养过程中，抑制E－cadherin蛋白的表达会影响PGCs之间聚集，在培养iPSCs时抑制E－cadherin蛋白的表达会使形成的细胞克隆解离。OSCs倍增时间约为22 h，增殖较慢；OSCs表达Ddx4、Oct4、Dazl、Blimp－1、Dppa3等生殖细胞及干细胞标志蛋白，但不表达Sox2、Nanog这两个多能性相关蛋白及卵母细胞减数分裂相关蛋白（如Gdf9、Sycp3、Zp3等）［54］。OSCs具有很高的端粒酶活性及碱性磷酸酶阳性，其碱性磷酸酶表达水平与SSCs相似，但比ESCs表达水平低。OSCs注射到SCID小鼠皮下后并不能形成畸胎瘤，也没有三胚层的分化。将OSCs注射到卵巢，可分化形成功能性卵子并产生健康子代，代表OSCs是一种单能干细胞，仅可分化形成卵子［45，54］。在小鼠及人的OSCs体外培养过程中，可自发分化形成卵母细胞样细胞。体外培养过程中根据DNA倍性分析可以检测到有单倍体细胞的产生［45］，这种自发分化产生的在形态上类似于卵母细胞的样细胞表达减数分裂相关基因（包括Sycp3、Dmc1、Nobox、Ybx2等）及卵母细胞透明带标志蛋白Zp3。

此外，通过基因芯片分析OSCs与SSCs的全基因表达，结果发现OSCs与SSCs在基因表达水平上具有很高的相似性。去除管家基因后，在OSCs高表达的1 273个基因以及在SSCs高表达的1 193个基因中，共有853个基因是两种生殖干细胞共同高表达的。这些共同高表达基因主要包括生殖干细胞标志基因（如Ddx4、Dazl和Oct4）及PGCs发育相关基因（如Tdrkh、Akt3、Gm1673、Hba－a1、Mov10l1、Fkbp6等）［55］。对ESCs、PGCs以及OSCs进行转录组测序（RNA－Seq）分析，结果表明，Nanog和Sox2在ESCs中特异性表达，而Ifitm3、Ptx3、GM1673在OSCs中表达［56－57］。

为了了解OSCs如何维持其单能性，对OSCs进行RNA－Seq分析，发现Prmt5在OSCs中高表达［56］。细胞免疫荧光染色试验结果表明，Prmt5主要在OSCs的细胞质中表达，将OSCs中的Prmt5基因敲减后，发现减数分裂相关基因（包括Sycp3和Sycp1）及卵子发育相关基因（包括Zp2和Zp3）上调。为了进一步了解Prmt5对OSCs基因表达的影响，对使用Prmt5敲减后的OSCs进行了RNA－Seq分析，与对照组相比，Prmt5敲减后OSCs中2 916个基因被上调，GO富集分析发现上调基因主要富集在与减数分裂相关的过程及一些与发育相关的生物学过程。这些研究表明，Prmt5参与了OSCs未分化状态的维持，其作用机制可能是通过抑制减数分裂和体细胞过程来维持OSCs干性［56］。在OSCs、ESCs两类干细胞具有相同的抑制分化机制。Prmt5与Mep50结合促进胞质组蛋白H2A（H2AR3me2s）甲基化，从而抑制ESCs的分化［58］，同样Prmt5与Mep50结合形成复合物在OSCs中也发挥抑制转录作用。除Prmt5外，还发现Max可抑制ESCs中减数分裂相关基因及其表达水平，同样当Max在OSCs中被敲减后一些减数分裂相关基因的表达被显著上调［59］。这些结果表明OSCs和ESCs具有某些相同的抑制分化机制。

2.4 OSCs的增殖调控

OSCs是存在于OSE中的一类稀有的干细胞，具有挽救因卵泡衰竭引起的女性不育的潜力。最近关于调控OSCs增殖的研究日益增多。

钙黏着蛋白在生殖细胞和干细胞中均有表达，并参与细胞黏附和信号转导等功能［60］。作为钙黏着蛋白超家族的成员之一，Cadherin－22最早发现于大鼠的垂体和大脑，具有两种剪接异构体长型和短型。长型Cadherin－22的胞质部分包含β－连环蛋白（β－catenin）结合结构域，而短型则缺乏该结构域［61］。小鼠卵巢中各阶段的生殖细胞包括OSCs均表达Cadherin－22［62］。已有的研究证明，短型Cadherin－22可通过JAK－STAT、PI3KAKT和TGF－β信号通路来促进大鼠SSCs存活及增殖［62－63］。Cadherin－22与PI3K相互作用后对AKT3进行磷酸化，可以增强细胞周期蛋白家族成员N－myc在OSCs中的表达水平，促进OSCs自我更新。

此外，作为TGF－β家族的成员，GDNF被认为是促进SSCs自我更新的关键因子。研究表明，GDNF对于OSCs自我更新也具有重要作用，GDNF与OSCs表面受体GFRα1结合，通过PI3K或酪氨酸家族激酶（SFK）激活AKT3，并且SFK也可上调其目标基因Bcl6b、Etv5、Lhx1，促进OSCs的自我更新［64］。研究表明，AKT3对于SSCs的增殖也至关重要［65］。AKT是一个多功能因子，参与了多个信号通路的调节，参与调节细胞不同的生物学功能，例如细胞增殖和细胞存活等，对于SSCs的增殖调节也具有关键作用。PIK－AKT－mTOR信号通路在维持SSCs自我更新上起到关键作用，PI3K由一个调节亚基p85和一个催化亚基p110组成，PI3K激活后，质膜上产生第二信使PIP3，PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT和PDK1结合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308，使AKT活化［66］。AKT磷酸化TSC1／2，可阻止其对小G蛋白Rheb（ras homology enriched in brain）的负调控，一方面使Rheb富集，另一方面活化对纳巴霉素（rapamycin）敏感的mTOR复合体（mammalian target of rapamycin，mTORC1）［67］。AKT也可以对GSK3β进行磷酸化，磷酸化后GSK3β失去活性，可以促进葡萄糖的代谢以及调节细胞周期。

2012年Hu Y.等［68］从新生和成年小鼠卵巢中分离了OSCs，并将其培养在ESCs的培养液中，结果表明，添加LIF和GSK3抑制剂BIO有利于OSCs形成类似于ESCs的Dome状克隆，BIO通过激活β－catenin和上调E－cadherin促进OSCs的增殖，并促进OSCs表达干细胞标志基因（如Oct4、Klf4、C－myc、Nanog、CD49f、Sox2、CD133、SSEA1和SSEA4）。

2.5 OSCs体外分化形成卵母细胞的研究

研究OSCs体外分化形成卵母细胞，对于生殖医学治疗因女性卵巢卵泡衰竭引起的不孕症具有巨大的临床应用价值。国内外的研究团队近年来致力于将小鼠或人的OSCs在体外分化形成功能性卵母细胞，进行了OSCs体外分化形成卵母细胞体系的比较。2018年，Zou K.等［69］比较了五种将OSCs分化形成卵母细胞的体系，将OSCs分化形成卵母细胞的第一步是诱导其进入减数分裂，在12.5 dpc的胚胎中。RA可诱导PGCs进入减数分裂。Zou K.等［69］将OSCs培养于添加RA的培养液（去除LIF）中，数天后观察到一些圆形细胞直径增长至25～40μm。随后将其培养在铺有一层颗粒细胞的微滴中，添加雌二醇、孕酮继续培养。结果发现，雌激素的添加有助于OSCs分化，最终形成形态上类似于GV期卵母细胞的样细胞，但继续培养后这些类卵母细胞样细胞并不能发育至MⅡ期。

2.6 OSCs的研究意义

近年来，有大量证据支持在包括小鼠、人类等各种哺乳动物的产后卵巢中存在具有有丝分裂活性的生殖细胞，这使得利用一种天然的具有生殖细胞命运的成体干细胞在体外分化形成功能性配子成为可能。目前的研究经过各种鉴定方式证实了OSCs在卵巢中的功能，包括体内移植试验成功获得配子以及人类OSCs分化形成卵母细胞样细胞的最新研究。这些研究使人们对雌性生殖生物学进行重新认识，并进一步探索OSCs对女性生育力保护的潜在应用价值。