哺乳动物植入前胚胎中细胞谱系分化的调控机制

孙克佳，李悦欣，高 旭，田树军，2*

（1.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071000；2.河北省牛羊胚胎工程技术研究中心，河北 保定 071000）

哺乳动物胚胎在植入子宫前先后经历了两次形态学上的变化。第一次形态学变化，人、猪和小鼠发生在8－细胞期，牛羊发生在32－细胞期，胚胎中各个卵裂球之间开始紧密接触，细胞间的界限变得模糊，这一过程称为胚胎致密化，这时的胚胎称为桑葚胚。随后胚胎细胞间开始聚积一些液体，逐渐在特定位置形成一个液体腔，称为囊胚腔，此时胚胎发育为囊胚。卵裂球在这一阶段分化为两种细胞，一种位于囊胚内侧，称为内细胞团细胞（inner cellmass，ICM）；另一种位于囊胚外侧，包裹着内细胞团与囊胚腔，称为滋养层细胞（trophectoderm，TE）。此时胚胎细胞完成了第二次形态学变化，也完成了第一次谱系分化。之后ICM逐渐分化为原始内胚层和上胚层［1］。

关于卵裂球是如何分化为ICM和TE的，前人以小鼠为模型提出了两种经典的模型，A.K.Tarkowski等［2］提出了嵌合模型，该模型指出卵裂球位置环境的不同导致其分化命运的不同，外层卵裂球分化为TE，内部卵裂球分化为ICM。另一种模型是M.H.Johnson等［3］提出的极性模型，指出8－细胞卵裂球的极化决定了细胞谱系分化的命运。细胞极化开始时胞内外物质不均匀分布在细胞顶端膜与基底膜，此时卵裂球由一个完全均匀的球体转变为极化的球体。在随后的分裂过程中，由于分裂轴的不同，致使胚胎卵裂球分裂为两个皆含顶端膜与基底膜的极化的卵裂球或一个含顶端膜与部分基底膜的极化的卵裂球和一个只含有基底膜的均匀卵裂球［4］，极化的卵裂球分布在胚胎外侧，均匀非极化的卵裂球逐步占据胚胎内侧。随后，外部的极性卵裂球之间形成了紧密连接、黏附连接、桥粒以及缝隙连接［5］，内部卵裂球之间形成了缝隙连接。形成一个紧密的桑椹胚，之后内部卵裂球形成ICM，外部卵裂球分化成为TE［6］。本文将阐述胚胎细胞谱系分化的调节机制，并重点讨论极性蛋白、相关信号通路和转录因子对胚胎细胞谱系分化的影响。

1 转录因子对胚胎细胞谱系分化的影响

转录因子（transcription factors，TFs）是动物细胞分化的关键调节因子，其中一些被确定为哺乳动物胚胎形成TE与ICM的特异性因子［7］，包括尾型同源盒基因转录因子－2（caudal－related homeobox transcription factor 2，Cdx2）、GATA结合蛋白－3（GATA binding protein3，Gata3）、八聚体转录因子4（octamer－binding transcription factor 4，Oct4）、Sry相关HMG盒2（Sry－relabed HMG box probein 2，Sox2）和Nanog同源框（Nanog homeobox，Nanog）。

1.1 胚胎发育过程不同时期转录因子表达的动态变化

在小鼠胚胎中，Cdx2、Gata3是TE的特异转录因子；Oct4、Sox2和Nanog为ICM 的特异转录因子。研究发现Cdx2与Gata3在8－细胞的部分卵裂球中表达，并逐渐向外部细胞聚集，最终只在囊胚的TE中表达。Oct4和Sox2在早期卵裂的各个阶段均有表达，但在囊胚形成后仅限于在ICM中表达。Nanog基因在桑椹胚中首次检测到表达，后维持在ICM中表达，TE中表达量下降［7－8］。此外，研究发现Oct4和Cdx2的表达存在颉颃作用，Cdx2可结合到Oct4基因的启动子区并抑制其转录［9］。同样Oct4可以结合到Cdx2的启动子区，导致其转录阻滞［10］。

在猪胚胎，Sox2在ICM 中特异性表达，Cdx2在TE中特异性表达；而Oct4在TE、ICM中广泛表达，没有特异性。说明在猪胚胎中，TE中的Cdx2不能有效抑制Oct4的表达。进一步研究发现Sox2与Cdx2在ICM和TE中表现互斥的表达模式，表明Sox2和Cdx2是猪早期胚胎的特异标记因子，在ICM与TE的分化中起到了关键的作用［11］。

在牛胚胎，Cdx2和Oct4在囊胚的ICM和TE中均有表达。其中Cdx2的mRNA在2－细胞、8－细胞期表达量较低，在桑葚胚和囊胚阶段逐渐上调，而Oct4在各阶段的表达量没有明显变化。进一步的研究表明，Cdx2不能与Oct4基因的启动子区域结合并抑制Oct4的表达，从而使Oct4在TE中表达［12］。

1.2 关键转录因子在TE和ICM形成中的作用

在小鼠胚胎中，敲除胚胎中Cdx2基因后，致密化、细胞极化、囊胚腔以及ICM可以正常形成，但胚胎不能形成成熟的TE，导致胚胎发育停滞［13］，表明Cdx2对于维持TE是必需的。通过RNAi干扰Gata3表达会导致囊胚的形成受阻滞［14］。在胚胎干细胞中，敲除Oct4的基因导致ICM分化为TE细胞［15］。Nanog作为Otc4的一个靶基因，被敲除后的小鼠可以形成正常的囊胚，但之后的胚外组织发育异常［16］。在牛中，降低Cdx2的表达水平不会影响囊胚发育率，但是会显著提高TEA转录因子4（TEA domain transcription factor 4，Tead4）的表达。Tead4在小鼠中通过Hippo型号通路调节Cdx2基因转录，不过Tead4与Cdx2在牛胚胎中的关系还需进一步研究［12］。

2 极性蛋白对细胞分化的影响

细胞极性影响胚胎细胞的命运。在胚胎发育过程中，极性不同的卵裂球有着不同的分化命运，内部非极性的卵裂球分化形成ICM，外部极性的卵裂球形成TE。而细胞的极性与极性蛋白的表达定位有关，因此研究极性蛋白的定位表达和相互作用是解释TE、ICM谱系分化的关键。

2.1 aPKC－PAR极性蛋白复合体

顶端极性蛋白／区域缺陷组件复合物（apical polarity protein／partitioning defective component，aPKC－PAR）是参与极性化作用的蛋白复合体之一，由区域性缺陷同系物3（partitioning defective 3 homologue，Pard3）、区域性缺陷同系物6（partitioning defective 6 homologue，Pard6）、非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C，aPKC）及ELKL基序激酶1（ELKLmotif kinase 1，Emk1）组成［17］。研究发现，这些极性蛋白在胚胎中的分布随胚胎细胞的分化而呈现动态变化。在小鼠胚胎中，Pard6b和Emk1在2－细胞～8－细胞阶段主要分布于细胞核，4细胞中的aPKC则主要分布于细胞质中。在细胞发生极化后，Pard6b和aPKC蛋白开始向细胞膜的顶端膜聚集，而Emk1则定位在基底膜区域。正是这种顶端－基底部的不对称分布，促进了细胞极化的形成［8］。研究发现，敲除小鼠胚胎中Pard6基因，会导致aPKC在细胞顶端的错误定位，造成细胞极化异常、囊胚腔不能正常形成，并且致使滋养层标志转录因子Cdx2的表达量较正常胚胎下降［18］。另一项研究表明，敲除Pard6后也会导致外部细胞中的血管泌素（Amot）定位紊乱，从而在外部细胞中激活Hippo信号，造成滋养层发育受损［19］。

2.2 CRB极性蛋白复合体

CRB极性蛋白复合体由crumbs蛋白质同源物3（crumbs protein homolog，crb3）、Lin Seven相关的蛋白质1（Proteins associated with lin seven 1，Pals1）和Pals1相关的紧密连接蛋白（pals1－associated tight junction protein，Patj）组成。在小鼠胚胎中，这些极性蛋白在胚胎发育过程中呈动态分布，在8－细胞之前均匀分布在卵裂球中。当致密化开始时CRB极性蛋白便出现不对称分布，其中Crb3和Pals1向顶端膜聚集，而Patj主要定位于基底膜的黏附连接处［20］，这与PAR极性蛋白复合体在致密化前后的分布相似。表明这些蛋白可以促进细胞极性的形成。此外，该项研究也对CRB极性复合体蛋白的功能进行了探讨，在敲除Patj基因后发现，CRB极性蛋白复合体和带状封闭蛋白－1（zonuia occluden－1，ZO－1）定位紊乱，胚胎的顶端－基底部极性、细胞骨架以及黏附连接的结构稳定性被破坏，最终导致囊胚发育异常［20］。在降低Patj的表达后发现，Hippo信号通路中的Yes相关蛋白（Yes－associated protein，Yap）定位发生错乱，使外部细胞中的转录共激活因子Yap发生磷酸化，无法进入细胞核与Tead4结合，Cdx2的表达受到抑制，最终导致TE无法形成。

综上对于PAR极性蛋白复合体和CRB极性蛋白复合体的研究表明，两者在植入前胚胎发育分化中分布较为相似，且通过调控Hippo信号通路影响胚胎滋养层的发育。有研究发现，在上皮细胞中PAR极性蛋白与CRB极性蛋白间存在着直接联系［21］，这些蛋白质复合物的定位是一个相互依赖的过程，Crb蛋白可以将Par6及其相关蛋白招募并稳定到细胞顶端区域。然而，在植入前胚胎中PAR极性蛋白与CRB极性蛋白间的联系尚不清楚。进一步揭示PAR极性蛋白复合体与CRB极性蛋白复合体在空间定位以及调控Hippo信号通路之间的联系是较有价值的。

3 影响胚胎早期分化的信号通路

3.1 Hippo通路

Hippo信号通路是由一系列激酶组成的级联信号通路，通过抑制下游的转录共激活因子Yap，调控靶基因的转录，进而调节细胞的增殖、凋亡及分化潜能等多种生物学行为［22］。

R.Yagi等［23］发现，在Hippo相关基因Tead4突变的小鼠胚胎中，Cdx2的表达明显下调，且胚胎中的细胞大多分化为ICM，这说明Cdx2的正常表达需要Tead4。进一步研究发现，在内细胞团中，Hippo处于激活状态，Yap被磷酸化并与细胞质中的蛋白结合而滞留于细胞质中，使Yap无法进入细胞核与Tead4结合［24］。在外侧的TE中，Hippo处于未激活状态，未磷酸化的Yap进入细胞核与Tead4结合，共调节cdx2等相关基因［25］。

在小鼠胚胎中，Hippo通路的激活与胚胎的极性化和细胞间的黏附连接密切相关［19］。在胚胎细胞极化的过程中，外层细胞出现顶部和基底部，顶部富含纤维状肌动蛋白（filamentous actin，F－actin）。而F－actin可以捕获Hippo中的关键因子，导致其不能对Hippo信号通路中的果蝇Warts、Wts同源物（large tumor suppressor1／2，Lats1／2）分子进行磷酸化，进而不足以使下游效应因子Yap磷酸化［26］。非磷酸化的Yap可以自由进入细胞核与Tead4结合，驱动滋养层中Cdx2和Gata3等基因表达等的适当转录激活。而内部细胞是非极性的，没有顶部与基底部之分。内部细胞中大多数的Amot会与细胞黏附连接处的钙调素蛋白（epithrllisl cadherin，E－cadherin）Ⅱ型神经纤维瘤病（neurofibromatosis type 2，NF2）等形成复合体。一旦复合体形成，Amot的第176位丝氨酸（S176）被磷酸化，进而通过磷酸化果蝇Lats1／2激活Hippo信号通路［19］。在Hippo处于激活状态时，Yap被磷酸化并滞留于细胞质中，无法进入细胞核与Tead4结合并启动Cdx2基因的表达［25］。由于Oct4与Cdx2间的表达存在相互抑制作用［9］，在Cdx2的表达量较低时Oct4的表达不再受到抑制，由此强化了内部细胞向ICM分化。因此，正是因为胚胎细胞极化导致Hippo信号通路的选择性开启，影响了胚胎细胞的谱系分化。

3.2 MAPK通路

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）是一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，可以被一系列细胞外信号或刺激激活。在哺乳动物中，MAPK的亚族主要包括细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK1／2）、c－Jun氨基末端激酶（c－Jun N－terminal kinase，JNK）以及 p38 促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen－activatedproteinkinase，p38－MAPK）。MAPK信号传导是以MAPKKK、MAPKK、MAPK三级激酶级联的形式进行，通过对一系列转录因子磷酸化进行基因表达调节，进而参与细胞的增殖、分裂及分化调节［27］。

抑制小鼠胚胎中p38－MAPK通路，发现8－细胞～16－细胞胚胎形态异常，囊胚的扩张和孵化减缓，细胞凋亡显著增加［28］。此外p38－MAPK缺失会导致F－actin形成受阻［29］，而F－action是胚胎致密化以及细胞分裂过程中的重要蛋白［4］。因此，在抑制p38－MAPK的小鼠胚胎中，其异常发育可能是缺少肌动蛋白导致的。除p38通路外，有研究发现抑制JNK通路也可以抑制小鼠胚胎发育［30］。不过在牛胚胎中，单独抑制一条通路并不会影响胚胎发育［31］，要同时抑制p38－MAPK和MAPK／ERK信号才会出现与小鼠胚胎相似的发育阻滞。近期有研究提出不同的观点，其在小鼠植入前胚胎中单独抑制p38－MAPK、JNK以及MAPK／ERK通路皆不会阻断囊胚发育，只有同时阻断3条通路，囊胚才会出现发育异常现象；同时检测到TE相关的特异性调控因子Cdx2与Gata3的表达明显下调，并且发育异常胚胎细胞骨架大部分呈弥散状态，肌动蛋白异常。推测是由于三条信号通路之间存在代偿机制，单一信号通路的抑制对胚胎发育影响较小，未表现统计学意义上的差异［32］。出现这种状况，还可能与小鼠的批次、使用的药品不同有关。此外，MAPK通路可以对细胞分裂造成不利影响。在抑制小鼠卵母细胞的MAPK通路后，卵母细胞出现纺锤体和微管组织异常，导致减数分裂失败［33］。与卵母细胞相比，抑制胚胎中的MAPK信号通路后是否会出现类似卵母细胞分裂异常的状况有待进一步研究。

虽然现已证明MAPK信号通路对胚胎细胞谱系分化至关重要，但MAPK通路对植入前胚胎发育的具体调控机制尚不清楚；MAPK通路的激活是否也与极性蛋白和黏附连接相关，以及在通路的下游如何调控Cdx2与Gata3的表达，均值得进一步探讨；此外，MAPK通路在卵母细胞中通过调控纺锤体和微管组织的形成介导卵母细胞发生减数分裂，而在哺乳动物植入前胚胎发育过程中，MAPK通路异常是否会造成纺锤体形成异常、染色体错位等异常反应并引起卵裂球分裂异常，有待进一步研究。

4 展望

综上所述，笔者在本文中探讨了一些转录因子、信号通路和极性蛋白对植入前胚胎谱系分化的影响，通过揭示植入前胚胎细胞谱系分化的分子机制，将有助于了解体外胚胎发育异常的原因、多能干细胞的分化发育机制等相关技术。然而，目前仍有许多其他相关的通路、基因等具体机制研究的不是很透彻，有待进一步探索。