哺乳动物乳铁蛋白的研究进展

文/郝文文 兰欣怡

（湖南农业大学动物科技学院）

1 乳铁蛋白概述

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，主要是由哺乳动物的乳房分泌的一种物质，即外分泌腺和中性粒细胞分泌的具有铁结合功能的阳离子糖蛋白[1]，分子量约80 kDa。体液中的乳铁蛋白分为不含铁、单三酸和双三酸3 种形式[2]，是转铁蛋白（Transferrin，Tf）家族的成员之一，在转铁蛋白家族中乳铁蛋白对铁的亲和力最强[3]。乳铁蛋白具有8.9的等电点（pI），在低于其pI的pH环境下带正电荷，可以与具有负电荷的蛋白质形成各种超分子结构[4]。

乳铁蛋白多分布在哺乳动物的泪液、唾液、血浆、胆汁、胰液以及小肠液中，少量存在于骨髓、血液中的中性粒细胞（PMN）、子宫内膜及胎盘，人乳铁蛋白还具有预防新生儿败血症和坏死性小肠结肠炎[5]，保护新生儿免受感染的作用，同时乳铁蛋白还能促进神经发育和认知[6]、刺激成骨细胞的增殖[7]和分化[8]、并抑制破骨细胞的形成[9]。

乳铁蛋白结构和性质较复杂，在生产方面，研究主要集中在人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白。王慧在论文中阐述，1939年，Sorensen首次在牛乳中一个未知的“红色组分”中发现，牛乳铁蛋白是一条由689 个氨基酸组成的单链多肽[10]。乳铁蛋白的氨基酸序列，包含2 个叶，在每个叶上包含1 条聚糖链并结合1个Fe3+[11]，其表面是由碱性氨基酸构成的糖胺多糖结合区域在静电引力结合下带有高度负电荷的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）[12]。

2 乳铁蛋白的生物学功能

乳铁蛋白具有多种生物功能，例如免疫调节功能，与铁的结合能力，抗菌、抗病毒和抗氧化作用，铁诱导的脂质过氧化保护，参与机体免疫调节，增强机体抗病能力等。

2.1 免疫调节功能

免疫调节作用是乳铁蛋白生物活性之一，可通过诱导体液免疫反应，促进抗原特异T细胞活性，调节细胞因子mRNA表达水平，影响淋巴细胞增生等途径发挥其免疫调节功能[13]。目前已证实乳铁蛋白可促进PMN、巨噬细胞对细菌的贪食以及细菌内的杀菌作用；促进PMN联合白细胞介素（Interleukin，IL）-28的放出；活化自然杀伤细胞（Natural Killer cell，NK）；抑制粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor，GM-CSF）的产生以及放出；抑制淋巴球的RNA翻译；抑制混合淋巴球的IL-21、IL-22以肿瘤坏死因子（TNF）的放出；抑制补体活性化等[14]。

乳铁蛋白在消化道酶水解作用下会释放具有生物活性的肽段——乳铁蛋白素[15]。，可促进肠道免疫，并具有显著作用，乳铁蛋白与免疫球蛋白和其他保护性因子相协调参与局部分泌免疫，并主要作用于靶细胞和靶细胞表面非特异性受体上，同时减少细胞损伤和促进损伤愈合作用，通过促进PMN在受伤部分的吸附和聚集，增加粒细胞黏性，促进细胞间的相互作用，调节免疫球蛋白的分泌，参与调节机体免疫耐受力，抑制补体系统的激活或激活已有的补体途径。大量试验研究表明，乳铁蛋白参与神经营养因子通路、参与机体代谢调节[16]，促进体液免疫。李娜等[17]对乳铁蛋白免疫调节作用的研究表明，乳铁蛋白具有明显的抑制小鼠外周血单个核细胞增殖的作用，且乳铁蛋白的抑制作用与其浓度存在相关性。当乳铁蛋白的浓度大于100 μg／mL时，抑制作用显著；当浓度为1 000 μg／mL时，抑制非常作用显著[18]。

2.2 乳铁蛋白与铁的结合能力

乳铁蛋白的许多生物活性与其铁饱和度和在不同作用条件下对铁的释放能力有关，这是因为乳铁蛋白中结合铁的多少会影响其分子构象。乳铁蛋白的结构虽然和血清转铁蛋白、血浆或乳浆中的转铁蛋白相似，但是其和铁离子之间的亲和力度较高，亲和常数约1 025，亲和能力是其他转铁蛋的260 倍[19]。因此，乳铁蛋白通过稳定还原态下的铁离子，来提高肠黏膜细胞细胞对铁的利用率，减少对肠道的刺激。与无铁乳铁蛋白对比，具有与铁结合能力的乳铁蛋白结构紧凑[20]，因为其每个氨基末端叶片和羧基末端叶片结构中都含有铁离子和碳酸氢根结构，和铁高度且可逆的结合（图1）。不同来源的乳铁蛋白在结构上相似，但不完全相同，因此，在某些活性方面也存在差异。氨基酸组成的结构域中存在乳铁蛋白中的铁元素，之间的裂缝可以通过叶子的结构变化而处于打开或关闭状态，当铁离子和多肽链相互结合时，裂缝闭合。研究人员还根据乳铁蛋白结合铁离子的数量，把乳铁蛋白分为铁饱和型乳铁蛋白、铁半饱和型乳铁蛋白和缺铁型乳铁蛋白3 种类型[21]。

乳铁蛋白可以促进肠黏膜细胞对铁元素的吸收，达到人体对铁元素需要的平衡态，可治疗妊娠缺铁性贫血[22]。但是，如果人体缺乏铁调节蛋白（IRPs）类的反馈回路，铁可以持续向大脑运输，可能会使大脑的铁含量增加到病理水平，从而引发阿尔茨海默病和帕金森氏病等神经退行性疾病[23]。

同时乳铁蛋白还有抗氧化作用，乳铁蛋白通过螯合Fe3+，减少羟自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH自由基）的产生，具有抗氧化作用。此外，乳铁蛋白可以抑制硫代巴比妥酸（TBA）和丙二醛（MDA）的生成；非饱和乳铁蛋白可以隔离自由铁，保护糖蛋白不被氧化剂氧化[24]。

2.3 消炎及抗肿瘤作用

由于牛乳铁蛋白能与铁特异性结合，因其生物学特性而广泛应用于功能性和治疗性产品，其中最重要的是抗菌活性[25]。基于其与铁的结合能力强、可直接结合到微生物膜上、可阻止微生物附着在上皮细胞或肠上皮细胞上3 个方面，而具有消炎作用。有研究人员发现，在有免疫球蛋白A（IgA）和溶菌酶存在的情况下，乳铁蛋白的抗微生物感染能力会增强。袁渝萍等[26]研究发现重组人乳铁蛋白能够抑制幽门螺杆菌的生长及增殖，且能不同程度地抑制幽门螺杆菌毒力因子及蛋白的表达，降低幽门螺杆菌致病性。Angulo-Zamudio等[27]研究的乳铁蛋白分解肺炎球菌生物膜发现，虽然乳铁蛋白抑制了肺炎链球菌在人类呼吸细胞上的定植，但是不影响浮游细菌的生存能力。

图1 乳铁蛋白的分子结构

研究表明，乳铁蛋白可能会干预侵入性恶性肿瘤细胞，预防致命细菌穿透宿主组织[28]。同时乳铁蛋白也是一种广谱抗病毒剂，主要用于病毒感染的早期阶段，其首先直接结合病毒颗粒，从而抑制其对靶细胞的入侵；其次根据靶细胞表面的病毒受体结构，进一步切断病毒与靶细胞；最后抑制病毒进入靶细胞后的自我复制过程，干扰病毒对靶细胞的吸附和侵袭，以此达到抗病毒作用。Gu Y等[29]通过高效液相色谱分离以及氧化物水平基底氧化测试后发现，牛乳铁蛋白中提取的血管紧张素转换酶抑制三肽低密度脂蛋白受体相关蛋白（lowdensitylipoproteinreceptorrelatedprotein，LRP），具有抗氧化和抗炎及潜在的抗高血压作用。乳铁蛋白属于非特异性免疫分子激活剂，可增强免疫细胞的杀伤作用，提高机体的抗病毒作用，抵抗病毒对人体引起的不良反应[30]，还可以使重症社区获得性肺炎患者外周血中的白细胞计数、中性粒细胞、降钙素原等在一定的时间之内产生下降趋势[31]。乳铁蛋白能促进正常细胞增殖，但对癌细胞却是起阻止而非刺激作用。乳铁蛋白通过阻碍体外培养的癌细胞由G1期向S期转化，并诱导改变细胞周期中一些重要调节蛋白的表达水平或活性，达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。此外，乳铁蛋白能够抑制内皮细胞的功能而发挥抗血管生成的作用。最新研究表明，乳铁蛋白能通过减少炎症或诱导细胞增殖，降低或修复由过氧化氢诱导的小肠上皮细胞损伤，研究者认为乳铁蛋白可作为一种预防和恢复肠道上皮损伤的潜在干预手段[32]，同时有些研究人员在妊娠母猪后期的饲料中加入了乳铁蛋白，发现乳铁蛋白不但可以提高幼崽初生重以及出生窝重，还可以提高仔猪的抗病能力[33]。

2.4 其他生物学功能

2.4.1 具有抗食物性病原体活性

食物性病原体阪崎肠杆菌（Cankobacter sakazakii）是一种依靠食物来传播的病原体，主要影响新生儿健康。科学家根据评估天然和铁饱和的牛乳铁蛋白对非干燥和干燥Cankobacter sakazakii的抗菌活性。试验结果表明，牛乳铁蛋白对Cankobacter sakazakii的抗菌作用主要是铁的螯合作用，通过与磷酸盐缓冲液比较，发现天然牛乳铁蛋白对非干燥Cankobacter sakazakii的抗菌活性在乳或乳清中显著降低；但同样条件下，对干燥Cankobacter sakazakii的抗菌性仍然存在[34]。

2.4.2 具有多种酶活性

在最新的研究结果中表明，牛乳铁蛋白类似于人乳铁蛋白，具有脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的活性。科学家运用了不同的方法，表明乳铁蛋白拥有较高的过氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶、蛋白酶和磷酸酶活性，且其蛋白酶活性是被镁离子和钙离子激活，其中具有ATP酶的活性的牛乳铁蛋白的只占3/7。同时，研究人员Svetlana等[35]发现，乳铁蛋白制剂具有不同水平的金属依赖性DNA酶和不依赖金属的RNA酶活性。原有的分析显示，脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的活性仅在对应的同类乳铁蛋白凝胶地方起作用。和人乳铁蛋白对比，牛乳铁蛋白对于人类肿瘤细胞具有较低的毒性。这些发现可以帮助理解这种多功能蛋白的多种生理功能，包括一些抵抗微生物和病毒感染的作用[36]。倘若生产时不注意卫生，就会让原本存在于牛乳中价值非常高的乳铁蛋白因卫生条件不加从而导致牛奶不能最大化利用，例如，埃塞俄比亚南部的阿瓦萨地区的奶牛所产的牛奶研究表明，分离出的金黄色葡萄球菌对青霉素G（PG）（10 μg），氨苄青霉素（AP）（10 μg）苯唑西林（Ox）（1 μg）产生了较强的耐药性，使得在人体中可以检测到部分的金黄色葡萄球菌，从而使牛奶中营养物质不能得到很好的表现[37]。

3 其他特性

3.1 过氧亚硝酸盐对乳铁蛋白的影响

以10：1摩尔比使用ONOO—（氧亚硝基阴离子）与酪氨酸处理，可以抑制天然乳铁蛋白的所有抗菌活性。硝化产品中Fe3+使α-螺旋特性显著降低，部分蛋白质展开，使牛乳铁蛋白保护细胞免受损能力下降。

同时，乳铁蛋白的铁结合能力在用过氧化亚酸盐治疗后也在减少，意味着乳铁蛋白防止细胞损伤的能力下降。再通过LC-MS/MS光谱测定法来鉴定乳铁蛋白肽硝化片段及包括在结合铁区域的酪氨酸残基Y92，这表明其通过过氧化亚酸盐的翻译后修改的乳铁蛋白，可能作为一个重要的加剧感染的途径[38]。

3.2 运用转基因奶牛、山羊群，生产重组人乳铁蛋白

与其他动物相比，人乳铁蛋白更适于人类食用，但一般情况下，人在非哺乳期不会产奶。随着全球对牛（羊）奶制品需求量增多[39]，科学家寻找合适的系统来进行人乳铁蛋白基因的异源表达。通过试验研究表明，在常用的表达系统中，人乳铁蛋白基因表达较为合适的器官是动物乳腺[40]，使用阳离子交换色谱净化原生态山羊乳铁蛋白，从而得到重组人乳铁蛋白。同时，不同的分析方法，如分光光度法等揭示，重组人乳铁蛋白是一个糖蛋白，且理化特征和原生态人乳铁蛋白相似，抑菌活性相似，消化性能稳定，铁离子结合和释放活力以及糖基化修饰相似[41]，并可促进成骨细胞的增殖分化[42]。

在SD大白鼠试验中，经科研人员长时间喂养得知，对SD大白鼠饲喂人乳铁蛋白全乳粉尚未出现安全问题，并且乳铁蛋白可能通过提高骨保护素（OPG）/细胞核因子KB受体活化因子配体（RANKL）正确比值，增加骨量和减少骨损失[43]，通过促进骨形成进一步维持骨代谢平衡，同时还可提高SD大白鼠机体铁的营养状况[44]，这意味着其可作为一个有前途的生物制药和食品补充剂[45]。

3.3 盐酸四环素与牛乳铁蛋白

根据热力学参数和分子嵌合进一步显示静电力力量，牛乳铁蛋白和盐酸四环素结合时需要使用到范德华力和氢键结合力。通过圆二色光谱等方法证实了牛乳铁蛋白确实和盐酸四环素有联系，并引起了牛乳铁蛋白的构造变化，再通过对牛乳铁蛋白表面的疏水性变化的分析，进一步研究牛乳铁蛋白和铁离子之间的捆绑力是否是因盐酸四环素对蛋白质功能产生了影响，从而使得捆绑力发生了变化。最后发现，牛乳铁蛋白和盐酸四环素之间相互作用，且两者之间的结合力非常强[46]。

4 乳铁蛋白的检测方法

根据现如今资料显示，对乳铁蛋白的检验方法主要有4 种：毛细管电泳[47]、高效液相色谱法[48]、分光光度法[49]、酶联免疫吸附法[50]。

4.1 毛细管电泳

近些年来，有科学家研究发现用毛细管电泳可以高效筛选牛乳铁蛋白适体[51]，通过采用不同测序深度的高输出和中输出2 种方法进行新一代测序。他们通过建立动态涂层毛细管电泳快速检测乳铁蛋白含量的方法，分析该方法对乳铁蛋白检测及纯度的验证是否有效[52]。此外，通过分子动力学模拟分析结合位点、相互作用力和结合自由能，来验证候选分子和牛乳铁蛋白的结合力。多次试验后发现，样品奶粉的牛乳铁蛋白检测结果与标示浓度基本一致[53]。

4.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法可以用来测定牛乳铁蛋白在无菌乳制品、发酵乳制品、婴幼儿配方食品等中的含量，同时还能测定不同品种牛奶中乳铁蛋白的含量。由于高效液相色谱法没有长时间的预处理以及分离层次，添加简单的预处理步骤是为了移除酪蛋白家族的脂肪和蛋白质，使得不同品种的乳汁对乳铁蛋白的洗涤程度不同，乳清中乳铁蛋白的洗脱量也不同，虽然对于有些样本如绵羊、奶牛及驴的乳汁所展示的峰的分辨率比较满意，但是观测山羊和人类的乳汁时，其峰分辨率会被其他峰干涉，但是乳铁蛋白的定量对所有样本都是可能的。通过改进的肝素亲和层析柱高效液相色谱法能使被测物种的乳汁样品中乳铁蛋白的测定成为可能，即可用于日常分析，也可作为一种定性筛选，来确保乳铁蛋白是否存在[54]。先在pH=8的磷酸盐缓冲液中将牛乳铁蛋白提取出来，在肝素亲和层析柱中洗涤，并在280 nm下使用C4层析柱高效液相色谱法检测和二极管阵列检测器检测。该方法提供了一个线性监测范围。10～1 000 μg/mL的定性限样品——0.6 mg/100 g液体样品和3.0 mg/100 g固体样品，以及定量限样品——2.0 mg/100 g液体样品和10.0 mg/100 g固体样品。此外，该方法让76%～96%的样品有更好的回收率，具有容易处理，灵敏度高以及精确度良好，回收率较高以及检测廉价的优势[55]。

根据李莉等[56]对比分析过乳铁蛋白酶联免疫检测试剂盒法和高效液相色谱法对婴幼儿配方食品中乳铁蛋白含量进行测定结果，最后发现这两种方法的测定结果无显著性差异，都可以被用来测定婴幼儿食品中乳铁蛋白含量。

4.3 分光光度法

分光光度法可以用来测定乳铁蛋白浓度，由于该方法对仪器设备的要求较低，因此，可以迅速测出乳铁蛋白的含量，但其准确度不高[57]。通常用于工厂分离提纯过程中的快速检测或是分析对检测结果准确度要求不高的样品分析。

4.4 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法灵敏度较高，操作较简单[58]，可以快速的检测出奶粉中的乳铁蛋白含量[59]。

5 总结

乳铁蛋白结构复杂，能够和铁离子亲密结合，同时还具有抗菌、抗病毒和抗氧化，参与机体免疫调节，增强机体抗病能力等作用，因而被运用在医疗、食品、药品等诸多领域。目前乳铁蛋白提取的量较少，但未来可以通过研究新方法提取出比率更多的乳铁蛋白。因此，乳铁蛋白的发展前景非常广阔，未来的研究方向主要是如何提取出更优质的乳铁蛋白应用于人类健康领域。