蓝白斑联合Sanger测序技术检测KRAS基因12位密码子突变

温博雅,彭翠英,徐 畅,周翠兰*

(1.南华大学衡阳医学院,湖南 衡阳 421001;2.南华大学衡阳医学院应用解剖学与生殖医学研究所，湖南 衡阳 421001;3.生态健康与人类重要疾病防控湖南省高校重点实验室，湖南 衡阳 421001;4.生物毒理与生态修复衡阳市重点实验室，湖南 衡阳 421001;5.有色金属矿区耕地重金属污染生态阻抗技术研究衡阳市重点实验室，湖南 衡阳 421001)

Kirsten大鼠肉毒病毒原癌基因同源基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS)突变与多种肿瘤的发生相关[1]。KRAS突变以点突变为主，而其中最常见突变为12位氨基酸突变[2]，其次为13位氨基酸突变。KRAS基因点突变与否与肿瘤的大小，类型及手术后是否复发相关[3]。在肿瘤的发生发展过程中，脱落的癌细胞与原发肿瘤组织癌细胞凋亡与坏死导致循环血液游离DNA含量增加[4]。经典的蓝白斑筛选原理认为，当外源DNA与含lacZ的载体连接时，会插入载体的多克隆位点(MCS)，使载体α肽链读码框破坏，此重组质粒不表达α肽链，导入宿主缺陷菌株不能产生活性β-半乳糖苷酶，不可分解培养基中的X-gal，培养表型呈现白色菌落。有文献报道[5]，当插入不含终止密码子的3N核苷酸片段(N<34)时，含插入片段的重组载体其α肽链读码框没有被破坏，能产生活性β-半乳糖苷酶，因而形成蓝色菌落;相反，当插入含终止密码子的3N核苷酸片段(N<34)时，由于其α肽链读码框因终止密码子的存在而遭到破坏，因此不能产生活性β-半乳糖苷酶，则形成白色菌落。本文模拟游离DNA，采用“蓝白斑筛选+酶切鉴定+Sanger测序”对KRAS基因12位密码子热点突变进行检测，以探讨此技术在检测稀发基因突变中的可行性，为肿瘤相关的部分体细胞基因突变检测提供一种新思路。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

PCR仪为朗基公司(中国杭州)生产，A200型。E Coli. DH5α菌株为天根(北京)生产，PspGI、BamHI、HindIII、PMD-19T为TaKaLa公司(大连)产品。质粒DNA提取试剂盒、100 bp DNA Ladder、dNTP、MixTaq、DNA Polymerase、T4连接酶均为Thermo Scientific产品。IPTG、X-gal、Tris-bas等试剂购于佳和生物(长沙)。

1.2 引物设计与合成

根据肿瘤体细胞突变数据库(COSMIC)提供的KRAS基因12位密码子热点突变及NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)提供的KRAS基因序列，利用引物设计软件Premier 5.0设计引物S1(正向引物)、S2(反向引物)与S3(正向引物)。S1序列为5′-GTTAGCCAAGCTTTGACTGCATACAAACTTGT-3′，S2序列为5′-CGTCAGGATCCTTGGACCATATTCGTCCACA-3′，S3序列为5′-GTTAGCCAAGCTTTGACTGCATACAAACTTGTGGTAGTTGGAC-3′，其中S3中3′的C为引入的PspGI酶切序列的C。S1与S2扩增得到产物双酶切后用于克隆，双酶切后获得的插入片段长度为102 bp，插入片段的长度为3的倍数(3N)。S2与S3扩增得到的产物用于酶切鉴定，所有引物序列由上海生工合成。

1.3 蓝白斑筛选检测混合质粒的PCR扩增产物

测定WT野生型与M12突变型质粒的OD值。M12突变型/WT野生型质粒分别以1∶30，1∶100，1∶300，1∶1 000的比例进行混合，WT野生型质粒最终浓度为2 ng/μL。以混合质粒为模板进行PCR扩增。PCR反应体系如表1所示。

表1 PCR反应体系

PCR扩增条件：预变性95 ℃ 1 min；变性95 ℃ 20 s，退火58 ℃15 s，延伸72 ℃20 s，共35 cycles；终延伸72 ℃ 5 min。

HindIII和BamHI酶切PMD-19T与PCR产物，琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化回收PCR产物与线性化载体，紫外分光光度计测定OD值。

PCR产物与载体连接。反应体系为10 μL，使插入片段含量为70 ng,载体的含量为20 ng,0.5 μL的T4 DNA Ligase，1 μL的10×T4 DNA Ligase Buffer。22 ℃反应30 min。将连接后的产物转化至E Coli. DH5α菌株。培养物涂抹于含有X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上，琼脂平板置于二氧化碳培养箱(5%)37 ℃培养15 h，观察结果并挑白色克隆进行酶切鉴定，将酶切鉴定为阳性的克隆进行Sanger测序。

2 结 果

2.1 质粒序列

2.1.1 重组质粒序列 M12突变型质粒与WT野生型质粒为本实验室构建[6]，插入片段的长度均为3的倍数的核苷酸长度(3 N),M12突变型质粒其TGG突变成TGA,序列见图1。

图1 质粒DNA序列图A:WT野生型质粒插入片段序列；B:M12突变型质粒插入片段序列

2.1.2 质粒引入酶切位点 采用引物S2与S3，以WT野生型质粒与M12突变型质粒为模板，引入PspGI酶切位点。WT野生型质粒的PCR产物含酶切位点，M12突变型质粒的PCR产物不含酶切位点。将PCR产物送金唯智测序，其序列图见图2。

图2 WT野生型与M12突变型质粒引入酶切位点测序图A：野生型质粒引入酶切位点后的测序图；B：M12突变型质粒引入酶切位点后的测序图

2.2 蓝白斑筛选检测KRAS基因12位密码子稀有突变

2.2.1 蓝白斑筛选技术检测稀有突变 如图3琼脂培养皿中长出了明显可见的白色克隆与蓝色克隆，证明蓝白斑技术能够检测KRAS基因12位密码子热点突变。通过改变阅读框架，当插入长度为3N的野生型片段至线性化载体，其阅读框架不含终止密码子，产生蓝色克隆。长度为3N的突变型片段插入线性化载体，其阅读框架含终止密码子TGA，产生白色克隆。

图3 蓝白斑检测KRAS基因稀有突变的克隆形成图a,b,c,d分别为M12/WT的比例为1∶30,1∶100,1∶300,1∶1 000的克隆形成图

2.2.2 蓝白斑菌落计数 不同比例混合模板的PCR产物与载体连接后，转化，接种到琼脂培养基上，计数蓝白菌落数量(表2)，蓝白菌落数比值高于M12突变型质粒/WT野生型质粒比值，此可能为蓝白斑筛选技术的假阳性造成。

2.2.3 白色菌落测序鉴定 在1∶1 000琼脂培养板上挑取4个白色菌落，通过引入PspGI酶切位点的引物进行菌液PCR扩增、酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到2个阳性克隆(图4)，即为突变型克隆，随后采用Sanger测序对插入片段的序列进一步验证。由于野生型扩增片段含有PspGI酶切位点，其扩增产物消化为更短的DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳中检测不出消化后的产物片段。

表2 不同比例M12突变型质粒/WT野生型质粒混合转化培养后菌落计数 (个)

图4 菌液PCR产物酶切电泳图

2.2.4 测序验证酶切鉴定阳性克隆 酶切鉴定为阳性的2个克隆，摇菌，提取质粒，送金唯智测序。经BLAST比对，为KRAS基因12位密码子突变型片段(图5)。结果提示蓝白斑筛选与Sanger测序相结合，可以检测出千分之一的突变，且能够消除蓝白斑筛选造成假阳性的缺点。KRAS基因野生型片段的基因型为TGG，突变型片段的基因型为TGA(图5)。

图5 阳性克隆测序结果红框内标注的为突变序列TGA，其相对应的野生型序列为TGG

3 讨 论

COSMIC数据库是最大的癌基因数据库，在数据库及文献中查询得知KRAS基因12位密码子突变是肺癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌等肿瘤中最常见的突变之一[2,7]。众所周知，肿瘤的发生发展卷入了相关基因突变等分子事件，因此对肿瘤进行早期的分子诊断为预防与治疗肿瘤显得尤为重要[8-10]。

当今有关肿瘤分子筛查技术层出不穷，但是这些技术均存在一定的技术局限，使其不能在临床上普及使用[11]。如熔点曲线具有高灵敏度，不需对后续的PCR进行处理，但并不是所有的突变都会有熔点曲线的变化[12-13]。位点特异性PCR灵敏度高，但有假阳性[14-15]。高保真聚合酶ON-OFF分子开关灵敏度高，同样也有假阳性[16]。在众多的方法中,测序分析是基因突变检测的金标准[17]。基因测序，包括Sanger测序(一代测序)与高通量测序(二代测序)这两种方法。当突变超过15%时，几乎所有的相关技术都可用于此类标本的检测，最为临床接受的方法为Sanger测序[17-18]。当突变高于1‰时，可以采用高通量测序进行突变分析[18-21]。高通量测序虽然更适合于肿瘤切除术后监控与靶向用药，但是高通量测序费用高，设备昂贵，数据分析复杂，不能在基层医院普及。Sanger测序虽然费用低廉，但是其检测突变灵敏度应在15%以上[18-19]，这限制了Sanger测序在基层医院用于早期癌症诊断的普及。

本实验通过人工合成模板按比例混合模拟游离DNA，采用蓝白斑筛选联合Sanger测序技术，对KRAS基因12位密码子突变进行检测，可以达到千分之一的灵敏度。蓝白斑筛选技术具有高效性的优点，假阳性的缺点。利用蓝白斑技术的高效性可以克服一代测序技术对稀有突变检测低灵敏度的缺点，这两种技术相结合能相互扬长避短。实验挑取特定颜色的阳性克隆进行酶切鉴定，再挑取阳性克隆进行Sanger测序，对插入片段进行验证。通过蓝白斑筛选、酶切与一代测序相结合对突变进行分析，结果显示此方法可以成功检测KRAS基因12位密码子热点突变。本研究所采用的方法可以用于对临床标本游离DNA进行KRAS基因12位密码子热点突变检测。此方法有一些潜在的优点，首先，作为一种无创性检测，被患者接受的概率较高；其次，本方法只需简单的设备及常规的分子生物学试剂，本技术操作方便，技术门槛低，可以在基层医院推广普及；第三，此方法检测成本低，检测费用低，普通百姓有能力支付相关检测费用。通过此方法对肿瘤切除术后的患者血中游离DNA进行监测，可以为患者的预后提供肿瘤基因改变的信息，以指导临床治疗；同时，利用这一原理开发更多实用的突变检测方法，未来有可能用于对临床检测疑似癌症患者的筛查或具有癌基因家族的个体进行预防性的早筛。

综上所述，本实验通过蓝白斑筛选、酶切与一代测序技术相结合，利用人工模板模拟游离DNA对KRAS基因12位密码子热点突变进行检测，可以达到千分之一的灵敏度，且无假阳性。实验结果提示通过对肿瘤突变基因循环cDNA进行蓝白斑筛选并结合一代测序，可以使基因突变检测达到更高的灵敏度，此方法适应于可转化为终止密码子的体细胞基因突变检测。通过调整阅读框架使之变为终止密码子，可以采用此技术进行检测。蓝白斑筛选与一代测序技术结合优劣互补，它们的结合使用可成为一种高效、灵敏、特异、经济、无创伤性的稀有基因突变检测新方法，可能具有广阔的市场应用前景。