大鼠脊柱融合模型构建及其应用的研究进展

刘 超，康 禹，晏怡果，王 程，王文军

(南华大学附属第一医院脊柱外科，湖南 衡阳 421001)

自20世纪初Hibbs[1]和Albee[2]开始将脊柱融合术应用到临床以来，脊柱融合术逐渐成为治疗脊柱退行性疾病的重要手段，同时脊柱融合术的应用也逐渐扩展到脊柱畸形和脊柱创伤的治疗当中[3-4]。脊柱融合的定义是某两个或者多个脊椎节段间经植骨术后形成骨性连接[5]。尽管脊柱融合术的手术技术和器械在近些年来有很大的改进，但常规后路腰椎间融合术融合失败的发生率仍有2%～15%[6-7]；为对脊柱融合术的技术和相应器械进一步改良以提高融合率，众多研究者通过构建动物模型来模拟人类脊柱融合的过程[8-9]。大鼠作为最常见的实验动物之一，与其它实验动物相比，具有传代时间短、价格便宜、在实验室环境下容易饲养等优势，近年来脊柱融合相关研究也开始采用大鼠作为实验动物，本文就大鼠脊柱融合模型的构建及其应用展开综述。

1 大鼠脊柱的局部解剖

大鼠的脊柱由57-60枚椎骨相连而成，整个大鼠脊柱可分为5部分：颈椎7枚；胸椎13枚；腰椎6枚；荐椎4枚；尾椎27-30枚[10]。O’Connell等[11]测量了大鼠和其它几种常用动物模型椎间盘几何参数，为了方便比较，所测得数据均进行标准化处理：高度和前后径长度均除以左右径长度，面积除以左右径长度的平方；分析发现大鼠腰椎和小鼠尾椎椎间盘结构参数与人类椎间盘较为接近。Jaumard等[12]利用Micro-CT技术对大鼠脊柱进行扫描并测量了相关解剖结构的具体数据，引入椭圆度的概念将大鼠脊柱与人类脊柱进行比较(椭圆度=左右径/前后径)，结果发现大鼠腰椎椎体椭圆度与人类接近，而且两个物种的颈椎和腰椎椎管椭圆度也是相似的，同时研究通过比较椎体高度与前后径之比发现大鼠的椎骨尺寸变化较大，较人类脊柱在形态上显得更为细长。

2 大鼠脊柱融合模型的构建

2.1 大鼠横突间融合模型

大鼠横突间融合模型于1992年首次报道，Guizzardi等[13]采用该模型研究了异体脱钙骨基质的骨诱导活性。随后，一些脊柱融合相关研究以此模型为基础展开，2003年Grauer等[14]为研究胸腺缺失对脊柱融合的影响，在研究中采用了大鼠横突间融合模型并详细阐述了此动物模型的构建方法：选取合适的节段(L4/5)，经后路正中切口充分暴露横突和小关节的外侧表面，刮除横突表面皮质骨，然后在横突间植入自体骨；通过人工触诊(L4/5节段无活动则判定为融合成功)以及组织切片染色验证该模型的成功构建，同时提出大鼠的脊柱融合观察时间应不少于6周。后续一些学者继续采用该模型进行相关研究：Koerner等[15]构建大鼠横突间融合模型继续深入探究植骨处的细胞因子及生长因子的表达情况；Ryu等[16]和Son等[17]则是在此模型上展开研究，阐述了激活素A/BMP-2(activin A/BMP2 chimera，AB204)嵌合体对骨融合的影响。大鼠横突间融合动物模型构建的手术时间短、创伤小，动物的存活率高、术后并发症少[18]；但此模型的主要缺点是由于之前的造模方式中融合节段并没有使用内固定，融合率往往偏低。

2.2 大鼠椎体间融合模型

除横突间融合模型以外，国内外研究学者还通过大鼠椎体切除或者椎间盘切除联合植骨的方法构建了椎体间融合模型。张兆飞等[19]利用手术植骨的方法成功构建了大鼠椎体间融合模型，实验分3组(A组、B组、C组)：在成功切除尾1椎体后，A组植入0.3 cm3髂骨、B组植入0.2 cm3髂骨、C组不植骨，然后在上下相邻椎体用磨钻各钻一个孔，安装内固定，3周后人工触诊初步评价融合情况：仅A组1只出现融合节段活动受限；6周后再次人工触诊：只在A、B两组出现融合节段活动明显受限(每组各4只)；进而通过切片组织学观察发现A、B组已融合的标本有骨桥形成，骨小梁互相连接，C组则未见新生骨组织形成。Okada等[20]则是为了研究重组人骨形态发生蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)对骨融合的影响，成功构建大鼠尾部椎间融合模型：切除第6/7尾椎水平椎间盘联合椎间隙植骨进行融合模型构建。由于具有暴露方便、操作简单的优点，大鼠尾椎在大鼠椎间融合模型构建中常被选择，但是大鼠尾椎血供较差、容易感染也是该模型构建失败的常见原因。而Rousseau等[21]所提出的大鼠腰椎前路手术入路为大鼠椎体间融合模型的构建提供了新的思路：取腹部正中切口，经腹直接显露大鼠腰椎，由于大鼠腹腔内胃肠道没有与腹壁背侧相连，因此腹腔入路可以暴露大鼠的大部分腰椎，该项研究为大鼠前路腰椎融合模型提供了解剖学基础。随后Damle等[22]对该造模方法的可行性进行了更加深入的评估：在左侧输尿管之间和下腔静脉之间进行钝性分离，将下腔静脉推到右侧，把横穿腰大肌的髂腰静脉结扎可以有效避免术中血管损伤和输尿管损伤，术中尽量避免损伤腰丛神经，降低术后并发症的发生。以上两位学者的研究利用腰椎前路手术入路构建大鼠椎体间融合模型具有可行性，且该入路更加贴近临床实践。

3 大鼠脊柱融合模型的评价方法

大鼠脊柱融合模型构建成功与否，需要有相应的评价方法来做进一步验证，目前主要有人工触诊、影像学和组织学等多种方法。在小动物融合模型中，人工触诊作为传统的评价方法，其操作简单：即徒手测试标本屈伸状态的受限程度，研究报道其灵敏度优于X线[23]，因而在研究中被广泛采用。此外，一些新技术也被用于融合评价当中来，Robinson等[24]设计了一个带有微型传感器的液压装置，对融合节段的刚度(刚度=力矩/位移)进行测试，从而评价该节段的融合情况。放射学检查评估包括X线[19,25]和Micro-CT[16-17,26-30]，X线需结合数值分级系统方能进行融合分级(表1)；Micro-CT则可以重建出直观的三维图像：分析三维骨小梁网络结构，准确的描述新骨形成的微观情况，并且可以得到准确的融合相关参数：骨体积/组织体积(Bv/Tv)、骨小梁厚度(Tb.Th.)、骨小梁数量(TB.N)和骨小梁间距(Tb.Sp)等，是目前评估骨融合、骨重建的重要手段。上述方法都是通过检查间接评价模型的融合情况，在评价模型是否发生成骨融合时，最终仍需要进行组织学检查，通过切片、染色对骨组织进行鉴定、观察，配合相应图片处理软件对骨组织进行定量分析，从组织学层面评价局部的骨融合情况[16-17,25-29]。

表1 放射学评分系统[21]

4 大鼠脊柱融合模型的应用

目前脊柱融合手术仍然有一定的融合失败率，因此一些研究以大鼠脊柱融合模型作为载体，围绕着提高脊柱融合率展开研究，探讨各种生物制剂对骨融合的影响。Koerner等[15]在大鼠横突间融合模型的手术节段局部使用不同剂量的rhBMP-2进行干预，结果发现在术后早期(1 h和6 h)高剂量组(100 μg)大鼠的白细胞介素-6和白细胞介素-1受体拮抗剂表达较高，而血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子和转化生长因子均表达较低，由此推论大剂量rhBMP-2可上调炎性细胞因子的表达，从而加重炎症反应，影响骨质愈合。Ryu等[16]利用大鼠横突间融合模型发现与rhBMP-2相比，局部应用A/BMP-2(activin A/BMP2 chimera，AB204)嵌合体的大鼠融合骨量和血清骨钙素较高，表现出了更好的成骨活性；而Son等[17]利用去势大鼠横突间融合模型也得到了相似的结果，提出在脊柱融合中AB204可作为rhBMP-2的良好替代品。Ishida等[26]通过在构建大鼠横突间融合术中局部应用万古霉素和妥布霉素，发现术中超剂量使用万古霉素虽然可以降低手术部位感染的发生，但是对脊柱融合质量也产生了不利影响。

近年来仿生支架相关研究已经成为骨科领域的热点，也有一些研究采用大鼠脊柱融合模型进行仿生支架成骨研究。Liao等[27]设计了一种胶原/β-磷酸三钙/羟基磷灰石复合载体，结合富含血小板血浆，在大鼠横突间融合模型上展开研究，结果发现植入富含血小板的复合载体的实验动物组融合情况明显优于其它组，其横突间观察到有较多骨小梁连接，而其余组仅见胶原纤维组织填充其中，由此得出结论：该种胶原/β-磷酸三钙/羟基磷灰石复合载体结合富含血小板血浆对大鼠腰椎融合具有促进作用。Salamanna等[28]采用羟基磷灰石仿生支架构建大鼠横突间融合模型，并复合锶或阿仑膦酸盐进行干预，8周后进行Micro-CT扫描，发现复合锶或阿仑膦酸盐的两组实验动物的骨体积分数和骨小梁厚度明显高于单纯支架组，其骨小梁数量更多、骨小梁间距也更为密集。Lin等[29]研制出一种结合了丹酚酸B(salvianolic acid B，SB)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA/β-TCP)复合支架，并应用于大鼠横突间融合模型，发现实验组骨体积比分数明显高于单纯支架组且与SB剂量呈正相关，CT血管造影显示新生血管生成也与SB剂量成正相关，与自体植骨组相比骨形成参数并无显著差异，得出结论：加入SB的PLGA/β-TCP支架可以通过促进成骨和血管生成来促进骨融合。

5 总结与展望

大鼠脊柱融合模型具有手术操作相对简单、动物容易饲养和观察周期短等优势，为研究脊柱融合这一临床重要问题提供了一种可行的动物模型。然而目前该模型也存在诸多不足之处，表现尤为突出的是模型的临床仿真度仍有不足，例如横突间植骨后无内固定、椎体间植骨多采用尾椎模型而不是腰椎模型、建模后大鼠脊柱缺少轴向应力刺激等。综上所述，通过改进模型制备方法更加贴近临床手术或术后诱导大鼠站立予以轴向应力刺激等，将构建出更为贴近临床实践的大鼠椎间融合动物模型，从而更好地服务于临床基础研究。