miR-34a靶向调控SOX7表达抑制垂体腺瘤细胞增殖

张笑天，张莉莉，孙苏安

(南京医科大学附属淮安第一医院病理科，江苏 淮安 223300)

垂体腺瘤多见于30～60岁女性，约占颅内肿瘤的22.5%，仅次于脑胶质细胞瘤和脑膜瘤。其因为影响内分泌系统，常引起全身代谢紊乱。同时，肿瘤浸润、破坏、压迫颅内腔，可导致严重功能障碍[1]。近年来，越来越多的研究表明，微小RNA(miRNA)靶向调控相关蛋白表达在控制肿瘤细胞增殖中起重要作用[2-4]。研究表明，miR-34a通过靶向调控血小板生长因子-β受体、MET原癌基因、TGF-β2受体，进而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移[5-6]。Y性别决定区基因7(sex determining region Y-box 7,SOX7)在肿瘤的发生及抑制中发挥重要作用[7-8]。本研究主要探讨miR-34a及SOX7在垂体腺瘤细胞增殖方面的作用及上下游关系。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠垂体瘤GH3细胞株(通派生物科技有限公司)；马血清、胎牛血清、F12K无血清培养基(Gibco公司)；MTT细胞活力检测试剂盒、碘化丙啶(PI)细胞周期检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；LipofectamineTM2000脂质体、Trizol试剂盒、PCR试剂盒(大连宝生物有限公司)；miR-34a mimics、NC-miR-34a、NC-SOX7、siRNA-SOX7(上海吉玛制药技术有限公司)；兔抗鼠SOX7多克隆抗体(Abcam)；兔抗鼠GAPDH单克隆抗体(Abcam)；山羊抗兔二抗(Proteintech)；引物序列(日本TaKaRa公司)；迷你双垂直电泳仪、迷你转印电泳仪(北京六一仪器厂)；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；FACS Calibur流式细胞仪(BD公司)；酶标仪(Thermo Scientific MultiSkan Go)；TS100倒置荧光显微镜(Nikon公司)；PCR仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司)。

表1 各引物序列

1.2 细胞培养

CH3细胞株在含有15%马血清和2.5%胎牛血清的82.5%F12K培养基中进行培养，培养箱环境控制在37 ℃，5%CO2，100%湿度。每2～3天更换1次培养液,5～6天传代1次。

1.3 细胞转染及分组

按照文献[9]的方法进行细胞转染，当GH3细胞汇合度大约达到50%时，利用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒分别转染不含miR-34a的空质粒(NC-miR-34a转染组)、含有miR-34a基因片段的质粒(miR-34a mimics转染组)、不含有SOX7的空质粒(NC-SOX7转染组)、SOX7小RNA干扰(siRNA-SOX7组)，另取未转染CH3细胞作为未转染组，转染6 h后，将培养液换成含10%血清的F12K培养基，培养48 h后，进行下述实验。

1.4 MTT法检测细胞活力[9]

将GH3细胞接种于96孔板中，按“1.3细胞转染”步骤进行转染，利用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒将含有基因片段或空载体导入细胞内，然后进行实验，48 h后，舍弃培养液，每孔加入20 μL终浓度为0.5 g/L的MTT，37 ℃继续培养4 h后，舍弃上清液，每孔加入150 μL的DMSO，通过震荡使紫色结晶物充分溶解，使用酶标仪于560 nm波长处测OD值。

1.5 Annexin V-PI染色检测细胞凋亡率[10]

(1)将GH3细胞接种于6孔板中，按“1.3细胞转染”步骤进行转染;(2)48 h后，用无EDTA胰酶消化细胞，将细胞收集到离心管中，1 000 g离心3 min，吸出上清液;(3)再加入1 mL预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中，离心，吸出上清;(4)加入195 μL结合液，重悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀后，再加入10 μL PI染液，轻轻混匀，室温避光孵育15 min;(5)用流式细胞仪检测。

1.6 流式细胞术检测细胞周期

(1)将GH3细胞接种于6孔板中，按“1.3细胞转染”步骤进行转染。(2)48 h后，用无EDTA胰酶消化细胞，将细胞收集到离心管中，1 000 g离心3 min，吸出上清液。(3)再加入1 mL预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中，离心，吸出上清。(4)加入1 mL预冷的70%乙醇，混匀，4 ℃固定2 h，离心，吸出上清液。(5)再加入1 mL预冷的PBS，混匀，离心，吸出上清。(6)每管细胞样品加入0.5 mL PI染色液，充分重悬混匀细胞沉淀，37 ℃避光孵育30 min。(7)使用流式细胞仪进行细胞周期检测分析。

1.7 荧光定量PCR检测miR-34a mRNA及SOX7 mRNA含量

采用TRIzol试剂法提取各组细胞中的总RNA，随后采用相关试剂盒对样品RNA进行反转录，进一步对cDNA进行扩增。引物序列如表一所示。扩增条件是：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火32 s，72 ℃延伸30 s，共计50个循环反应。采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。△△Ct计算公式：△△Ct=(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。

1.8 Western blot检测细胞中SOX7蛋白表达

Western blot主要步骤为：将各组细胞加入细胞裂解液裂解细胞，低温离心，取上清液采用BCA试剂盒进行蛋白定量；配制SDS-PAGE凝胶，上样后，进行电泳、转膜、封闭；在4 ℃条件下兔抗鼠SOX7多克隆抗体(1∶1 000)，过夜；在室温条件下孵育山羊抗兔二抗(1∶4 000)；使用ChemiDocTM XRS凝胶成像系统成像，并用Image J进行半定量分析。

1.9 统计学方法

2 结 果

2.1 细胞活力测定结果

与未转染组或NC-miR-34a转染组比较，miR-34a mimics转染组细胞OD值显著降低;与NC-SOX7转染组比较，siRNA-SOX7组细胞OD值显著降低，上述结果表明上调miR-34a或下调SOX7表达均可降低垂体腺瘤细胞活力(表2)。

表2 各组细胞活性比较

2.2 细胞凋亡率

采用流式细胞术Annexin V-PI染色检测细胞凋亡率，结果显示，与NC-miR-34a转染组比较，miR-34a mimics转染组细胞凋亡率增加，与NC-SOX7转染组比较，siRNA-SOX7组细胞凋亡率增加。上述结果表明上调miR-34a或下调SOX7表达均可增加垂体腺瘤细胞凋亡率(图1，表3)。

图1 流式细胞术Annexin V-PI染色A：未转染组；B：NC-miR-34a转染组；C：miR-34a mimics转染组；D：NC-SOX7转染组；E：siRNA-SOX7组

2.3 细胞周期分布

采用流式细胞术PI染色检测细胞周期，结果显示，与NC-miR-34a转染组比较，miR-34a mimics转染组细胞G1期延长，S、G2期缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。与NC-SOX7转染组比较，siRNA-SOX7组细胞G1期延长，S、G2期缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明上调miR-34a或下调SOX7表达均可延长垂体腺瘤细胞G1期，缩短S期和G2期(表4)。

表3 各组细胞凋亡率比较 (%)

表4 流式细胞术检测各组细胞周期结果 (%)

2.4 miR-34a mRNA及SOX7 mRNA含量

如表5所示，与NC-miR-34a转染组比较，miR-34a mimics转染组细胞中miR-34a mRNA含量增多，SOX7 mRNA含量减少。与NC-SOX7转染组比较，siRNA-SOX7组细胞中SOX7 mRNA含量减少。上述结果表明，上调miR-34a表达可抑制垂体腺瘤细胞SOX7 mRNA表达。

表5 PCR检测miR-34a及SOX7相对mRNA含量

2.5 细胞中SOX7蛋白表达水平

Western blot检测SOX7蛋白表达见图2，其相对表达量见表6，与NC-miR-34a转染组相比，miR-34a mimics转染组细胞中SOX7蛋白的相对表达量降低。与NC-SOX7转染组比较，siRNA-SOX7组细胞中SOX7蛋白的相对表达量降低。上述结果表明上调miR-34a表达可抑制垂体腺瘤细胞SOX7蛋白表达。

图2 各组细胞SOX7蛋白A：未转染组；B：NC-miR-34a转染组；C：miR-34a mimics转染组；D：NC-SOX7转染组；E：siRNA-SOX7组

表6 SOX7蛋白的相对表达量

3 讨 论

miRNA参与多种生物学过程，例如，转录调节、细胞分化和肿瘤增殖。相关研究[10]表明，miR-34a可能通过调节PI3K/Akt和MAPK信号通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖。研究表明，在乳腺癌和肺癌中已经发现miR-34a表达异常[11-12]。迄今为止，关于miR-34a对于垂体腺瘤细胞的生物学作用及作用机制的研究较少。SOX7的表达与许多肿瘤的发生有关，在前列腺癌及乳腺癌中SOX7mRNA表达水平降低[13-14]；但在胰腺癌中SOX7mRNA表达水平升高[15]。上述结果表明：SOX7在不同的肿瘤细胞中的表达具有差异性。因此，本研究主要就miR-34a及SOX7在垂体腺瘤细胞增殖方面的作用及上下游关系进行一系列的研究。

本研究将miR-34a mimics及siRNA-SOX7转染到细胞内时，细胞经MTT染色后，miR-34a mimics转染组和siRNA-SOX7组细胞活力OD值分别低于NC-miR-34a转染组和NC-SOX7转染组，该结果提示上调miR-34a或下调SOX7表达均可降低垂体腺瘤细胞活力。通过Annexin V-PI染色分析上调miR-34a或下调SOX7表达对垂体腺瘤细胞凋亡的影响，结果显示miR-34a mimics转染组和siRNA-SOX7组细胞凋亡率分别高于NC-miR-34a转染组和NC-SOX7转染组，该结果表明上调miR-34a或下调SOX7表达均可增加垂体腺瘤细胞凋亡率。用流式细胞术检测细胞周期，结果显示miR-34a mimics转染组和siRNA-SOX7组S期、G2期分别低于NC-miR-34a转染组和NC-SOX7转染组，G1期分别高于NC-miR-34a转染组和NC-SOX7转染组，上述结果表明上调miR-34a或下调SOX7表达均可延长垂体腺瘤细胞G1期，缩短S期和G2期，进而抑制细胞分裂增殖。

通过实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法分别检测上调miR-34a表达或下调SOX7表达对垂体腺瘤细胞SOX7基因及蛋白表达的影响，结果显示miR-34a mimics转染组细胞中SOX7 mRNA相对表达量和SOX7蛋白水平均低于NC-miR-34a转染组，该结果与siRNA-SOX7组结果一致，上述结果提示上调miR-34a表达可抑制SOX7表达，从而发挥其抑制垂体腺瘤细胞增殖的作用。既往研究[6]结果显示miR-34a可靶向TGF-β2受体抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，但在本研究中miR-34a是否通过靶向TGF-β2受体下调SOX7表达，亦或通过下调SOX7表达靶向TGF-β2受体抑制垂体腺瘤细胞增殖仍有待开展试验进一步研究。

综上所述，miR-34a mimics能够通过靶向负调控SOX7表达，诱导垂体腺瘤GH3细胞凋亡，并抑制细胞增殖，使细胞周期阻滞在G1期。其机制还需进一步研究。