益生菌与功能发酵乳开发研究进展

李 楠，刘振民

（乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436）

联合国粮农组织和世界卫生组织联合专家委员会于2001年提出益生菌科学定义：益生菌系指活的微生物，当摄取足够数量时，对宿主健康有益。在“健康中国2030”、“国民营养计划”等国家战略推动下，消费者逐步树立起追求高品质生活的大健康理念，治未病意识不断增强，益生菌市场规模迅速扩大。但在益生菌产业快速发展过程中，存在着益生菌概念使用不当、核心菌株鉴别不清、功能特性难以科学界定等问题[1-2]，难以满足多元化和功能化的行业需求。

2020年发布的《益生菌的科学共识》[3]明确指出益生菌的3 个核心特征：足够数量、活菌状态以及有益健康功能。益生菌宣称的有益健康功能，应当建立在作用机制明确、临床评价科学严谨以及相当规模的循证医学论证基础之上。益生菌在产业化应用前，必须经过科学、规范的验证流程，明确菌株来源地及来源样品、保藏日期、种属乃至基因组信息、典型培养基和培养条件、生理生化特征、生长发酵曲线、菌株相关文献和专利、菌株扩大培养（产业化）等情况，之后应当对菌株的适应性、安全性和益生特性等进行评估，最后选择功效明确的益生菌剂量/组合应用于商业化产品[4-5]。

目前，益生菌在食品中主要应用于发酵乳制品、饮料、保健食品、婴幼儿配方食品等[6]。我国发酵乳制品的消费规模占国内益生菌整体市场的78.4%，是国内益生菌产业的重要增长动力之一；发酵乳制品作为益生菌的优良载体，已经成为我国乳品工业中增长幅度最大的产品种类，年平均增长率接近20%；我国发酵乳产量从2001年的55.1 万t增长到2017年的742.3 万t，表现出强劲的发展势头；2018年，中国乳制品市场发酵乳销售额首次超过牛乳，标志着进入发酵乳时代；益生菌制剂、功能性发酵乳及乳酸菌饮料等相关产品已形成千亿元的庞大市场[6]。

近年来，益生菌理论研究不断突破，技术成果加速转化，益生菌与功能发酵乳产业蓬勃发展，引起科学界和产业界的高度关注。本文对益生菌功能机理、遗传转化及代谢调控的研究现状和发展进行阐述，并进一步探讨功能发酵乳制品的开发，以期为益生菌和功能发酵乳的应用开发提供理论依据。

1 益生菌功能机理研究进展

益生菌在生物体内发挥功效主要通过3 种途径：菌体、代谢产物和益生元。

1.1 菌体作用

益生菌是一类能够通过改善肠道菌群平衡，从而对人体产生有益健康作用的活性微生物。益生菌的主要作用是通过消化道生物的竞争排斥作用，帮助建立有利于宿主健康的胃肠道微生物群落，促进营养物质消化吸收，保持消化道健康[7]。

益生菌能够耐胃酸、耐胆盐，以活菌状态到达肠道，并且在肠道内定植和大量增殖，形成优势菌群，构成肠黏膜表面的天然屏障，从而减少病原微生物侵染[8]。益生菌还能够竞争性消耗肠道中的营养物质，从而抑制有害微生物生长[9]。冯军厂[10]研究发现，干酪乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等益生菌能够通过竞争性结合肠上皮细胞Caco-2，从而抑制沙门氏菌、大肠杆菌等肠道有害细菌的定植和生长。

1.2 代谢产物

除了通过竞争和拮抗机制来维持肠道菌群健康，益生菌还可以通过合成和分泌初级代谢产物或次级代谢产物抑制有害细菌。主要原因之一就是益生菌在生长代谢过程中产生短链脂肪酸等有机酸类物质（如乙酸、丙酸、丁酸、乳酸），能够降低肠道微环境pH值，抑制有害细菌生长[11]。

胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是乳酸菌生长代谢过程中分泌到胞外、具有独特理化性质和生理功能的一类高分子糖类化合物，属于微生物次级代谢产物。目前已经报道的产EPS乳酸菌包括嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）及肠膜明串珠菌（Leuconos to cmesenteroides）等。乳酸菌EPS除了具有增稠、保湿、乳化、稳定等常规理化特性外，还具有抑制癌细胞生长、增强机体免疫力、降低胆固醇以及调节血压等生理活性，因而其在保健方面的应用引起极大关注[12-14]。

20世纪40年代开发出的由肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）产生的右旋糖酐是最早被开发利用的乳酸菌同型EPS，也是美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）首次批准的可应用于食品的微生物EPS[15]。

1.3 益生元

益生元通常无法被人体消化道分解、吸收和利用，因而不能直接对机体发挥作用，而是被肠道菌群选择性吸收利用，通过促进体内有益菌的代谢和增殖，从而对机体产生健康功效，主要包括改善肠道菌群、促进脂质代谢和矿物质吸收、调节便秘和腹泻等[16]。益生元主要包括功能性低聚糖、多糖、植物提取物、蛋白质水解物和多元醇等。目前常用的益生元有低聚果糖（fructooligosaccharide，FOS）、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉及螺旋藻等[17]。

FOS是一种天然活性益生元，一般是由蔗糖分子的果糖残基连接1～3 个果糖形成的碳水化合物，作为一种天然水溶性膳食纤维，FOS存在于很多水果和蔬菜中，具有降低血清胆固醇、促进钙质吸收等生理功能。近年来，在许多低聚糖类食品中，FOS作为一种最常用的益生元受到国际营养学家和科研工作者的广泛认可。FOS含有能够双向调节人体微生态平衡的超强双歧因子，具有保健功能确定和食品配料优良的双重特性，已被广泛应用于食品工业，备受现代食品生产企业和消费者青睐[18]。FOS具有溶解性好、甜味纯正清爽、稳定性高、保湿性好、不易结晶等良好物理化学性质和加工特性，同时还具有改善肠道微生物种群比例[19]、促进双歧杆菌、乳杆菌等有益菌快速增殖[20]、抑制致病菌生长繁殖[21]等生理特性。另外，FOS能有效降低空腹血糖水平，因而非常适合糖尿病患者及肥胖者食用。

早些年已有大量体内和体外实验证实FOS对益生菌的选择性增殖作用，但是乳酸菌代谢FOS的机制直至近年来才有报道。目前公认的FOS代谢方式主要有2 种：1）通过细胞膜上的特异性运输载体将FOS完整转运至细胞内，再由细胞内的果糖苷酶水解，以供菌体利用；2）先由菌体分泌至胞外的果聚糖水解酶等胞外酶对FOS进行水解，然后将水解产物转运至胞内[22]。为适应不同的生存环境，乳酸菌经历了大量基因组退化和适应性进化，因而在不同种乳酸菌间存在多个不同类型的转运系统和水解酶系[23]。

2 益生菌代谢调控研究进展

2.1 益生菌分子遗传学研究

尽管乳酸菌和益生菌具有不同的分类定义，不能完全等同，然而大量研究发现，许多乳酸菌均具有益生特性。在属水平上，双歧杆菌属和乳杆菌属是主要的益生菌，有超过200 个种被证实具有益生功效，包括维持肠道菌群平衡、预防便秘和腹泻、增强免疫力、抑制肿瘤、调节血糖、血压、血脂和修复肠道黏膜屏障功能等[24-27]。

随着微生物基因组学等多组学技术的发展，人们对于益生菌分子遗传学的认知也在不断扩展。乳酸菌遗传多样性和分子生物学研究已经达到了相当的高度，主要是从水平基因转移和可移动遗传元件角度进行分子遗传机理解析和基因工程改造。大量的重要益生菌株被发掘，包括不同来源的分离株，如来自植物、肠道、天然发酵食品等；目前已经公布全基因组序列的乳酸菌超过400 株，并且仍在不断增加；乳酸菌全基因组数据解析结合比较基因组学等研究，不仅可以全面掌握乳酸菌的重要遗传背景信息，为乳酸菌分类鉴定和遗传进化提供科学依据，还可以系统阐述乳酸菌的发酵特性及生理代谢机制，为优良菌种选育、改造和应用提供理论指导；根据基因组数据，益生菌的生理功能具有菌株特异性，与菌株独特的生态位相关；目前，乳酸菌进化的趋势主要分为两类，一类是栖息地的普适性，另一类是栖息地的专一性；菌株与宿主的共进化带来了更多益生特性，并且驱动益生菌的进化[28-29]。

根据现有研究报道，乳酸菌基因组大小一般为1.7～3.4 Mb，其中明串珠菌基因组较小，仅1.7 Mb左右，而植物乳杆菌基因组普遍较大，达3.3 Mb左右，可能与其环境适应能力较强有关；单个菌株通常含有1 600～3 200 个基因，并且所有乳酸菌都含有假基因，但数量差别较大，表明乳酸菌仍处于活跃的进化过程中[28]；乳酸菌基因组中的GC碱基含量一般为50%，其中双歧杆菌含量最高，部分菌株超过60%；乳酸菌质粒的种类极其丰富，在不同种属间广泛存在，主要包括11 个属：双歧杆菌属、短杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、酒球菌属、片球菌属、链球菌属、四联球菌属及魏斯氏菌属，大小从0.87 kb到超过250 kb，拷贝数从每个细胞1 个到超过100 个，给宿主带来不同表型；乳酸菌基因组中普遍含有插入序列及前嗜菌体序列，为乳酸菌进化过程研究提供了直接证据[29]。

近年来，许多研究详细阐述了乳酸菌适应环境变化的进化过程，主要是在基因组层面上发生大量改变，暗示着乳酸菌对于栖息环境的积极适应。然而，针对环境变化引起的适应性进化并非均具有共同特征。研究表明，同种乳酸菌基因组变化的程度并非仅仅为适应某种特定环境而生存，而是为产生更多表型，以适应更广泛的环境[28]。近年来的大量基因组数据揭示了乳酸菌基因组功能的复杂性以及它们对环境的适应性。

研究表明，基因组进化与微环境、栖息地及生态位等环境因素密切相关，因而可以推测，具有较大基因组的乳酸菌能够更好适应生态环境，因为它们具有更强的代谢能力和压力耐受性，具有较小基因组的乳酸菌则大多数生活在某些特定或相对静止的环境中，它们无需应对剧烈的环境变化，基因组往往被压缩[29]。

有报道称，大量假基因、插入序列和较低的GC碱基含量是基因组退化的主要特征，事实上，这些变化都是乳酸菌进化过程中对环境的生理适应；许多乳酸菌经历了巨大的基因组退化，可能归结于从自由生存到宿主依赖型生活方式所带来选择压力的减少[29]。

有证据显示，益生菌的基因组大小与环境分布存在关联性；目前检测到的乳杆菌基因组最小化均与其适应特定生态环境相关，如胃肠道环境；许多乳杆菌定植于动物胃肠道，它们与宿主之间存在着共进化关系，因此，乳酸菌和双歧杆菌与宿主的这种选择性关联，导致其在共进化过程中丢失大量基因组信息[28]。

基因组最小化和代谢简化是乳酸菌基因组进化过程中的主要趋势，然而，研究者仍然经常检测到大量的重复基因和新基因，这些重复基因和新基因在一些栖息地十分专一的乳酸菌中被发现，如干酪中存在的瑞士乳杆菌含有许多编码不同种类肽酶或蛋白酶的基因，研究者认为这种现象是通过水平基因转移发生的；基因丢失、水平转移、基因上调及大量突变，这些变化在乳酸菌基因组中普遍存在[28]。

2.2 乳杆菌EPS合成及调控机制研究

乳酸菌能够产生大量不同组成的EPS，EPS具有改变基质流变学特性、产生益生功效、提高菌体压力耐受性以及促进生物膜形成等作用。目前对于EPS的需求越来越大，因而研究者开始关注如何通过代谢工程来提高其产量。

干酪乳杆菌LC2W是从内蒙古传统发酵乳制品中筛选到的益生菌，经体外测试和动物实验证实，该菌株具有降血压功能和免疫活性，并且其生理功能很可能与分泌到胞外的EPS密切相关[30]。然而，该菌株同大多数乳酸菌一样，EPS产量较低且调控机理不明，严重制约其大规模工业化应用。通过近年来的研究，对干酪乳杆菌LC2W产EPS的遗传学基础、生化类型、生物合成途径、代谢模式及生理活性等有了一定了解，使得对其开展EPS生物合成和调控机制研究成为可能[31]。

2.2.1 乳杆菌遗传操作体系建立

乳杆菌是一类重要的革兰氏阳性细菌，也是经美国FDA批准的一般认为安全的微生物，常常被作为食品级表达载体的宿主或疫苗的抗原递送载体，进行重组蛋白表达和目标产物合成[32]。因此，利用现代分子遗传学技术对乳杆菌进行遗传改造正受到越来越多的关注。在乳酸菌的遗传转化研究中，由于载体的便利性和转化效率较高，乳酸乳球菌一直是主要研究对象。而乳杆菌遗传转化效率较低，极大限制了乳杆菌作为遗传工程宿主进行外源基因表达、基因功能鉴定和代谢机理解析等研究[33]。

目前，对于乳杆菌的遗传转化操作主要包括原生质体转化和电转化2 种。原生质体转化法由于操作过程复杂、技术要求高、遗传稳定性差等缺点逐步被淘汰。电转化法是利用瞬时高强度电压在细胞膜表面造成一定时间内可修复的孔洞，使得外源大分子（如DNA）能够进入细胞，从而进行遗传改造。电转化法具有操作简便、快速、高效等优点，成为现今乳杆菌遗传操作的主流方法。任婧等[33]在培养基中添加1 g/100 mL甘氨酸作为细胞壁弱化剂，制备干酪乳杆菌感受态细胞，在10 kV/cm的电场强度下进行电转化，通过3 h复苏培养，获得了较高转化效率，为1.25×106CFU/μg DNA；经优化后，该方法在植物乳杆菌、乳酸乳球菌等多种乳杆菌中实现了高效电转，为乳酸菌的遗传改造和基因功能解析提供了参考。

2.2.2 乳杆菌产EPS影响因素

乳杆菌EPS的产量和种类具有明显的菌株差异，不同菌株的EPS产量差别很大。即使是同一菌株，在不同的生长发酵条件下，其EPS合成能力也有明显差别[34]。培养基中的碳源和氮源、发酵温度、pH值、发酵时间、菌株生理状态（是否活化）等是乳酸菌EPS合成的主要影响因素，在不同的培养基成分和发酵条件下，乳酸菌EPS的分子结构和生理活性也存在较大差异[35]。

前期研究中，国内外学者主要通过菌株分离筛选、培养条件优化和紫外诱变等方法获取EPS高产菌株，然而传统的菌株筛选和优化方法受到菌株自身特性限制，无法大幅改变EPS合成能力。近年来，随着乳酸菌遗传操作方法的丰富和完善以及乳酸菌遗传背景和EPS生物合成机制解析，利用基因工程和代谢调控等手段进行乳酸菌遗传改造，从而使提高EPS产量成为可能[36-37]。

从代谢机制上看，乳杆菌EPS合成受多重因素的影响。首先是糖核苷酸复合物。在野生菌株体内，糖核苷酸复合物的表达水平通常很低，成为限制EPS产量的瓶颈。有研究发现，增加尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖和尿嘧啶核苷-5’-二磷酸半乳糖等前体含量，能够有效提高乳酸菌中EPS产量[38]。其次是EPS代谢途径的关键酶和中间产物。有研究报道，磷酸葡萄糖变位酶和焦磷酸化酶是乳酸菌EPS生物合成途径中的关键酶，负责催化形成葡萄糖-1-磷酸等中间产物，通过调节关键酶的表达和活力能够提高乳酸菌EPS产量[39]。第三是EPS基因簇。有研究者通过在乳酸菌中异源表达EPS合成途径，成功实现了不产EPS菌株的EPS生物合成[40]。

2.2.3 代谢调控提高EPS产量

针对乳酸菌开展代谢工程改造的优势在于，其生物合成能力及代谢功能相对有限，碳源代谢和能量代谢较为简单，代谢通路清晰[39]。随着乳酸菌分子生物学研究的不断深入，其序列分析及遗传背景等信息日趋完善。因此，利用代谢工程技术进行乳酸菌遗传改造和代谢调控成为研究热点。在很多报道中，研究者利用分子生物学方法改进代谢途径中关键酶的表达，提高酶活，对菌株中心碳代谢途径和EPS生物合成途径进行代谢调控，进而显著提高了重组菌株的EPS产量[40-41]。

通过对干酪乳杆菌LC2W基因组数据的分析和基因组探矿，找到2 段负责EPS合成的基因簇，其中eps1基因簇序列与Yakult代田株中eps基因簇完全一致；通过KEGG代谢途径比较，构建干酪乳杆菌LC2W的EPS合成代谢通路，并分析得到可能的限速步骤；利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）分子克隆技术，从不同来源的乳酸菌中克隆得到8 个潜在的关键基因，为EPS代谢调控提供了参考[42]。

利用基因工程手段和代谢工程思路向干酪乳杆菌LC2W菌株内导入EPS代谢途径中潜在的关键基因，通过比较发酵产量，找出限速步骤，为选育EPS高产菌株提供依据，也为干酪乳杆菌LC2W的EPS合成调控提供理论支撑。

利用代谢工程手段对影响EPS合成的潜在关键基因进行逐一考察，结果表明，过表达nox、pfk、rfbB和galT基因对于EPS产量影响较大，EPS产量分别提高46.0%、20.0%、17.4%和19.6%；其中，提高菌株烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）氧化酶活力的策略最为有效，该方法能够显著减少重组菌株乳酸的积累量，节省的碳源流向EPS合成途径，使得EPS产量大幅度提高[31]。另外，尽管干酪乳杆菌属于厌氧菌，在氧气存在的情况下菌体生长不佳，然而重组干酪乳杆菌LC-nox在有氧发酵条件下过表达的NADH氧化酶活力更高，使得EPS产量最高达263.7 mg/L，比无氧发酵条件下产量高出近30%[42]。由此可见，利用代谢调控手段能够显著改善乳酸菌的EPS合成能力，具有工业应用前景。

2.3 植物乳杆菌ST-Ⅲ全基因组序列分析及FOS代谢通路解析

植物乳杆菌在自然界中分布广泛，一般存在于植物体表、发酵面团、发酵果蔬汁、乳制品及肉制品中，与人类生活密切相关。作为人体消化道的天然菌群之一，植物乳杆菌具有多种益生功能，包括改善肠道菌群、降低血清胆固醇含量、增强免疫力、排出重金属、促进营养物质吸收等[43]。同时，植物乳杆菌在许多发酵基质中具有旺盛的生长代谢能力，因而在食品发酵、工业品制备和医疗健康等领域有着广泛应用。随着近年来植物乳杆菌全基因组测序工作的完成及分子改造技术的进步，对于植物乳杆菌的研究已经从传统的生理生化和发酵特性，逐步拓展到分子机理解析和代谢途径改造。

2.3.1 植物乳杆菌ST-Ⅲ全基因组序列分析

植物乳杆菌ST-Ⅲ是从传统发酵泡菜中分离筛选到的具有降胆固醇功效的益生菌株，2011—2012年完成全基因组测序，其基因组大小为3 254 376 bp，GC碱基含量为44.58%，菌体内含有1 个大小为53 560 bp的天然质粒，GC碱基含量为38.69%，染色体上含有3 035 个开放阅读框，其中21 个为假基因[44-45]。

通过基因组注释发现，植物乳杆菌ST-Ⅲ中含有一个脂肪族磺酸盐ABC转运系统。据报道，该系统往往与菌体清除胆固醇的能力有关[44]。因此，这个转运系统的存在为植物乳杆菌ST-Ⅲ耐受胆盐和清除胆固醇的特性提供了理论依据，也为降胆固醇益生机理解析和潜力菌株筛选提供了思路[46]。

虽然植物乳杆菌ST-Ⅲ基因组含有大量编码氨基酸合成和蛋白水解相关酶的基因，然而该菌株与其他植物乳杆菌一样无法单独在乳中生长；经过遗传分析发现，这可能与植物乳杆菌缺失细胞壁蛋白酶有关。细胞壁蛋白酶的缺失将导致菌株无法正常利用乳培养基中丰富的酪蛋白作为氮源，从而限制其生长代谢[46]。

pST-Ⅲ质粒是所有植物乳杆菌中发现的最大质粒之一，它属于θ型复制质粒，结构比滚环型复制质粒更加稳定[47]，更易于进行DNA片段剪切和插入等分子克隆操作，从这一点来看，pST-Ⅲ有作为克隆载体的可能。

植物乳杆菌ST-Ⅲ来源于传统发酵泡菜，能够耐受7.5 g/100 mL NaCl的高盐浓度，比一般乳酸菌具有更好的耐渗透压能力[48]。通常认为，质粒的存在与宿主菌株适应特定的生存环境有关[28]。质粒消除实验结果表明，pST-Ⅲ质粒与菌株的渗透压耐受性有很大关联[46]。

2.3.2 FOS代谢机制解析

FOS是应用最为广泛的益生元之一，已有大量实验证明，FOS能够选择性增殖有益菌双歧杆菌和乳杆菌，然而其在菌体内的代谢机制尚未完全阐明。不同种属益生菌具有不同的FOS代谢途径，许多在肠道中栖居的非益生菌也同样具有代谢FOS能力[49-51]。

植物乳杆菌基因组中含有多个与低聚糖和糖醇代谢相关的基因簇，这些基因簇一般由编码相应转运蛋白、调控蛋白和糖类水解酶的基因构成；通过同源比对，在植物乳杆菌ST-Ⅲ基因组中共发现12 个相关基因簇，比植物乳杆菌WCFS1和植物乳杆菌JDM1各多2 个，表明其可能具有更好的低聚糖和糖醇代谢能力；这些基因簇的分布区域较为集中，且GC含量明显低于基因组其他部位，碱基组成差别较大，因此可以推断这些基因簇可能通过水平基因转移等方式来源于其他微生物[46]。

除基因簇之外，植物乳杆菌ST-Ⅲ基因组中还存在许多与低聚糖代谢相关的功能基因，并且存在多个拷贝数。基因编码的冗余会造成菌体代谢负担，但也可能会给菌体带来较好的碳源利用能力，以适应不同的生存环境。通过基因组序列分析发现，植物乳杆菌ST-Ⅲ含有多个编码果糖苷酶的基因，与其他植物乳杆菌比较，有2 个基因具有植物乳杆菌ST-Ⅲ菌株特异性，表明植物乳杆菌ST-Ⅲ具有较好的FOS代谢能力。另外，植物乳杆菌ST-Ⅲ基因组中还含有2 个磷酸葡萄糖转移酶系统和2 个果糖ABC转运系统，可能与FOS转运能力相关[46]。

2.3.3 FOS代谢通路关键酶β-果糖苷酶基因克隆表达及酶学性质研究

β-果糖苷酶主要负责催化水解蔗糖等寡糖中的果糖苷键，有些还具有转糖基作用，能够催化β-呋喃果糖残基转移至蔗糖或其他糖、醇等[52]，该酶是一种胞外酶，在许多FOS产生菌（如黑曲霉、节杆菌等）和代谢能力较强的菌株中都有发现；来源于双歧杆菌或乳杆菌的β-果糖苷酶不具有转糖基作用，主要负责催化水解蔗糖、菊粉、FOS等碳水化合物，为菌体生长提供碳源[53]。不同微生物产生的β-果糖苷酶具有不同的底物亲合力、反应动力学和最适反应条件等酶学特性，因而FOS代谢能力往往具有菌株特异性[54-56]。

植物乳杆菌ST-Ⅲ作为益生菌，能够较好利用益生元FOS。转录组分析发现，当以FOS作为碳源时，植物乳杆菌ST-Ⅲ中负责编码β-果糖苷酶的基因sacA表达水平显著上调；根据同源建模分析，β-果糖苷酶包含2 个大的结构域，一个是催化位点，位于N端，具有β-螺旋桨结构，另一个是底物结合位点，位于C端，具有β-三明治结构；另外通过比对发现，与长双歧杆菌的β-果糖苷酶结构类似，植物乳杆菌ST-Ⅲ的β-果糖苷酶在蛋白质N端同样含有α-螺旋结构[46]。据报道，该结构目前只存在于乳杆菌和双歧杆菌来源的β-果糖苷酶中，推测该区域与胃肠道消化系统的适应性有关[46]。

鼠李糖乳杆菌LGG来源于健康人体肠道，是研究最多、应用范围最广的益生菌之一，然而该益生菌无法利用益生元FOS作为碳源生长。为了验证植物乳杆菌ST-Ⅲ中sacA基因的功能，Chen Chen等[56]将其在鼠李糖乳杆菌LGG中进行异源表达，通过乳酸菌表达载体pSIP403的诱导表达发现，当以FOS作为唯一碳源时，鼠李糖乳杆菌LGG野生型菌株虽然可以生长，但生长极其缓慢，而构建的重组菌株鼠李糖乳杆菌LGG-sacA则能够快速生长，表明过表达来源于植物乳杆菌ST-Ⅲ的sacA基因赋予重组菌株较好的FOS代谢能力。上述研究说明，SacA酶是微生物代谢FOS的关键酶，可以在不同乳杆菌中进行表达并显示出较好活性，弥补了SacA酶缺失菌株无法较好利用FOS的问题，同时也进一步证实通过分子生物学技术能够更好对传统益生菌进行遗传改造，增强其代谢益生元能力[46]。

2.4 重组乳酸菌作为疫苗给药载体

食品级的乳酸菌是最佳的给药载体，利用益生菌作为动物和人体的黏膜疫苗传递系统是一个重要的研究方向。与传统疫苗相比，黏膜疫苗传递系统具有副作用小、给药方便、黏膜系统反应迅速等优势。许多乳酸菌具有酸耐受性和黏膜定植能力，这些特性有利于黏膜给药，并且大剂量口服乳酸菌不会带来风险。口服乳酸菌也不需要对活性物质进行分离纯化，降低了给药成本。

目前，已有很多乳酸菌作为疫苗给药载体的应用。大多数用于治疗的食品级载体均为整合型，整合至染色体使得载体更加稳定。Martin等[57]利用来源于卷曲乳杆菌的apf基因，在副干酪乳杆菌中构建染色体整合表达载体，利用副干酪乳杆菌重组菌株表达的抗体能够有效结合轮状病毒，并且使小鼠免受病毒感染。Alvarez-Siero等[58]构建了一株食品级干酪乳杆菌重组菌，其染色体上整合了一段经过密码子优化的pep基因，能够将黄色黏球菌的脯氨酰内肽酶输送至病人的十二指肠。Steidler等[59]构建了表达和分泌鼠源白细胞介素-10的乳酸乳球菌，并证实了其治疗2 种不同类型肠炎的有效性。

使用CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）系统能够对乳酸菌和双歧杆菌等进行理性设计和精准编辑，这为疫苗传递和生物疗法提供了有效保证。通常，可以利用菌体自身的CRISPR系统或引入外源Cas9:sgRNA系统进行DNA编辑。依靠此技术，研究者已经将詹氏乳杆菌、格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌和阴道乳杆菌等成功开发为黏膜疫苗传递载体[60]。

3 功能发酵乳制品的开发

3.1 免疫调节益生菌发酵乳

EPS作为益生菌代谢产物之一，发挥着重要的益生功效。干酪乳杆菌LC2W能够产生3 个不同分子质量的EPS，经细胞实验证实，其中的2 个组分G1和G2具有较好的体外免疫活性，在一定浓度下，对于T淋巴细胞和B淋巴细胞具有促进或抑制增殖作用，并且G2具有明显的剂量效应，其抑制作用与浓度呈正相关[61]。

吴江等[62]采用PCR-变性梯度凝胶电泳方法，考察干酪乳杆菌LC2W EPS对人体肠道菌群的影响，并通过高效液相色谱方法分析短链脂肪酸组成，结果发现，与菊粉相比，添加干酪乳杆菌EPS可以促进短链脂肪酸合成，保持肠道菌群多样性，具有调节肠道菌群平衡的作用。干酪乳杆菌LC2W发酵产物对α-葡萄糖苷酶抑制率可达（39.98±0.08）%，可以用于生产具有α-葡萄糖苷酶抑制活性、控制餐后血糖、膳食补充剂等功能性配料，具有辅助治疗糖尿病的作用[63]。

3.2 植物乳杆菌增殖技术及产品开发

植物乳杆菌ST-Ⅲ能够在肠道内定植，具有调节肠道菌群、降低胆固醇等生理功能，可改善血液中甘油三酯水平[64]。同时，在代谢FOS益生元方面展现出良好功能特性，能产生较多短链脂肪酸，还具有促进肠道有益菌（双歧杆菌）生长的功效[65]。

针对植物乳杆菌在牛乳基料中不增殖、难以达到高活菌数、发酵风味接受度低、组织状态难稳定等技术难题，采用国际领先的增殖技术、创新的配方和工艺设计，最终生产出高活菌数、清爽美味、体系稳定的活菌型乳酸菌饮品，每瓶（250 mL）含有千亿植物乳杆菌ST-Ⅲ活菌[66]。

4 结 语

目前，益生菌和功能发酵乳的概念已被广泛熟知和认可，然而对于益生菌的科学研究仍需不断深入。尽管近年来许多益生菌在临床功效评价和机制解析方面取得了一定进展，但是不少研究结果仍处于推测和假定阶段。未来，益生菌功能基因组学等多组学的不断发展，将为益生菌生理功能的系统解析提供更好的理论指导和技术手段，为特定功能益生菌的准确评价和定向筛选提供更好的思路和方法。发酵乳制品是益生菌的良好载体，吸收现代的益生菌科技成果，加强循证医学方法论证，基于生物活性效应分子及生物活性评价，增加临床研究数据，新型发酵乳制品将为人类健康做出更多贡献。

同时，越来越多证据显示出益生菌作为重要营养补充剂对于人体健康的功效具有菌株特异性和个体差异性，不存在适用于每个人和所有体质的“万能”益生菌。因此，需要让更多消费者了解益生菌发挥健康功效的科学机理，清楚益生菌“量”和“效”的科学关系，使消费者能够科学、理性选择满足自身需求的益生菌和功能发酵乳。