快速检测发酵乳中葡萄糖杆菌的赖解旋酶恒温基因扩增方法的建立

刘 东，张 捷，朱华东，周 巍*，张 岩*

（河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050091）

发酵乳是乳及其加工制品在特征性微生物的作用下发酵生成的酸性凝乳状制品，特点是保质期内所含特征菌大量存在，并且能够保持活性继续存活[1-2]。发酵乳不仅含有原料乳中全部的营养成分，其添加的益生菌也在互利生长的同时赋予发酵乳更丰富的营养价值和保健作用[3-4]。随着社会的飞速发展及生活水平的不断提高，人们对食品的关注点已经从安全、满足需求转向养生、保健[5]。发酵乳因自身特有的营养和保健功能，关注度和受喜爱程度越来越高，成为当今乳制品研究与开发的主要方向[6]。

发酵乳因pH值较低、含有较多益生菌，使得广大消费者误认为发酵乳本身相对较为安全[7]。但是实际情况不尽其然，发酵乳富含蛋白质、乳糖等营养成分，容易受到微生物繁殖、代谢的影响，从而导致腐败变质[8]。葡萄糖杆菌常见于糖含量较高的环境中，造成发酵乳的污染[9-10]。发酵乳中葡萄糖杆菌的质量控制需要精准的检测技术体系作为支撑。

目前常见的食品中葡萄糖杆菌检测方法主要为传统常规培养生理生化法和分子生物学检测方法。常规生理生化检测方法需要进行增菌、分离，检测周期长，费时费力，且存在漏检现象，很难满足市场快速、准确的检测需求。常规聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术存在扩增反应时间长、扩增效果受到多种因素影响、常引起非特异性扩增、需要昂贵的PCR仪等缺陷，导致其难以在基层推广应用[11]。依赖解旋酶恒温基因扩增（helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）法是以PCR法为基础发展起来的体外恒温基因扩增方法，主要利用解旋酶在恒温条件下解开DNA双链，同时单链DNA结合蛋白使解开的单链保持稳定，为引物提供结合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互补链，新合成的双链在解旋酶作用下又形成单链，并作为下一轮合成的模板进入循环扩增反应，最终实现靶序列的指数增长[12-13]。该方法具有仪器设备简单、时间短及特异性强等优点。目前，该技术已在食源性致病菌检测中有了一定应用[14]。

本研究将HDA方法应用到发酵乳中葡萄糖杆菌的检测中，利用HDA法自身优势，结合基层对于过程控制的需求，开发能够满足基层检测及现场检测的HDA检测体系，为发酵乳生产企业的过程控制提供必要的技术保障，也为HDA技术在其他污染菌和致病菌检测中的应用推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵乳样品购自当地超市和农贸市场，共计200 个批次。本研究所需要的菌种如表1所示。

表 1 实验用菌株Table 1 Strains tested in the study

脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）、高效液相色谱级引物、DNA Marker、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、Tris-HAc 生工生物工程（上海）有限公司；T4 gp32蛋白、UvrD解旋酶、Bst聚合酶 美国New England Biolabs公司；Phi29嗜温聚合酶、海藻糖、RecA蛋白、多胺、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美国Sigma公司；营养肉汤培养基、MRS液体培养基、双歧杆菌培养基、脑心浸液培养基、牛肉膏微量元素培养基 北京陆桥技术有限责任公司；实验所用菌株均为本实验室保存菌株。

1.2 仪器与设备

Whatman T Gradient PCR基因扩增仪 德国耶拿分析仪器股份公司；Gel Doc（MP）凝胶成像系统、电泳槽、电泳仪 美国伯乐公司；DK-98-1电热恒温水浴锅 余姚市东方电工仪器厂；BHC-300IIA/B3生物安全柜 苏州净化仪器设备有限公司；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司；NanoDrop 1000微量核酸蛋白测定仪 美国Thermo公司；3K15冷冻高速离心机 德国Sigma公司；MIR254恒温培养箱美国Thermo公司；MS3振荡涡旋混匀器 德国IKA公司；FiveEasy Plus™ pH计 瑞士梅特勒-托利多公司；Reference®2微量电动移液器 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA的提取

Reagent D溶液处理葡萄糖杆菌培养液：1）将传代3 次的葡萄糖杆菌培养液充分摇匀，吸取100 μL增菌液加入到2 mL灭菌透明离心管中；2）将Reagent D溶液从―20 ℃取出，室温放置融化，取400 μL Reagent D溶液加入到1）中离心管，室温下避光培养5 min；3）将离心管放置于低温离心管架，置于500 W的卤素灯正下方15～20 cm处，曝光培养5 min后，8 000 r/min离心5 min；4）用移液器小心去除上清液，向离心管中加入100 μL无菌去离子水充分混匀，用于基因组DNA提取。

采用FoodProof磁珠提取仪法提取葡萄糖杆菌基因组DNA：1）取1 mL Reagent D溶液处理后葡萄糖杆菌培养液加入2 mL离心管中，8 000 r/min离心5 min，弃上清，添加700 µL Lysis Buffer及80 µL蛋白酶K，65 ℃振荡水浴30 min，12 000 r/min离心5 min，准备好上清液，用于DNA提取；2）准备仪器需要的Tip plate、Binding plate、Washing plateⅠ、Washing plateⅡ、Washing plate Ⅲ、Elution plate，并根据需要使用微量移液器或排式微量移液器将每种板子对应的Buffer添加至需要使用的样品孔；3）其中Binding plate每个样品孔添加250 µL Binding Buffer和20 µL磁珠颗粒，2 种液体需吹打混匀；Washing plateⅠ每个样品孔添加600 µL Washing BufferⅠ；Washing plateⅡ每个样品孔添加800 µL Washing BufferⅡ；Elution plate每个样品孔添加80 µL Elution Buffer；4）移取第1步离心完毕的Lysis Buffer 500 µL至已添加Binding Buffer和磁珠颗粒的Binding plate相应样品孔；5）打开仪器电源开关，选择细菌提取所需的MPKⅣ程序；6）重复按START按钮，根据屏幕指示分别将Tip plate、Binding plate、Washing plateⅠ、Washing plateⅡ、Washing plate Ⅲ、Elution plate放置到指定位置；7）当所有平板装载完毕后，点击START按钮，仪器完成核酸自动提取程序大约需要35～40 min；8）程序运行完毕后，根据仪器屏幕指示逐步卸载已经完成核酸提取任务的Tip plate、Binding plate、

Washing plateⅠ、Washing plateⅡ、Washing plate Ⅲ、Elution plate，此时DNA已溶解于Elution plate，可用于后续PCR实验，及时将已经完成核酸提取任务的Binding plate、Washing plateⅠ、Washing plateⅡ、Washing plate Ⅲ相应样品孔的废液用微量移液器移除；9）使用微量移液器将Elution plate上提取的DNA分别转移至干净的离心管中，使用Elution Buffer定容至80 μL，可直接用于PCR实验或4～8 ℃保存3～7 d，或―20 ℃长期保存。

1.3.2 引物设计

通过分析葡萄糖杆菌的基因序列，选择进化稳定、属水平特异、种水平通用的目的基因作为引物设计的序列，设计引物。将FAST格式葡萄糖杆菌的目的基因导入Primer Premier 6.0软件设计引物，利用Oligo 7.37软件进行电子PCR验证，筛选获得特异性较强的引物对进行实验，最终获得HDA法检测葡萄糖杆菌的特异性检测引物，如表2所示。

表 2 引物序列与目的扩增产物大小Table 2 Primer sequences and size of PCR products

1.3.3 HDA反应体系优化和建立

采用一步法H D A 反应体系，检测体系：5 μ L 10×Buffer（含350 mmol/L Tris-HAc、100 mmol/L二硫苏糖醇、1 mg/mL BSA和100 mmol/L MgSO4）、10 UBst聚合酶、0.16 μmol/L ATP、0.04 μmol/L dNTPs、0.1 μg UvrD解旋酶、25 μmol/L海藻糖、5.0 μg T4 gp32、2 μL模板DNA、终浓度为20 pmol/L的引物，用ddH2O补至50 μL[15-16]。由于HDA反应体系的主要成分浓度相对固定，仅对反应体系中UvrD解旋酶、T4 gp32的添加量进行优化。

UvrD解旋酶添加量的优化：选择50 μL添加0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μg进行实验，确定不同靶标菌株反应体系中较适UvrD解旋酶添加量。

T4 gp32添加量的优化：选择50 μL添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg进行梯度实验，确定不同靶标菌株反应体系中较适T4 gp32添加量。

最终获得HDA法检测发酵乳中葡萄糖杆菌的反应体系。反应条件：金属浴65 ℃恒温2 h。

结果检测：2%琼脂糖凝胶电泳检测。恒压100 V，电泳45 min（待指示剂到达琼脂糖凝胶底部附近），通过凝胶成像系统Gel Doc（MP）进行成像分析。

1.3.4 HDA法检测葡萄糖杆菌的特异性

将表1与葡萄糖杆菌进化关系较近并且易影响检测结果的醋化醋杆菌、液化葡糖醋杆菌、单核细胞李斯特菌、大肠埃希氏菌、阪崎克罗诺杆菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、食蔗糖葡糖醋杆菌、婴儿双歧杆菌、汉氏葡糖醋杆菌、蜡样芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌及嗜热链球菌经复苏培养后，按照1.3.1节建立的方法提取相应菌株的基因组模板，加入建立并优化的反应体系进行检测，验证HDA法检测葡萄糖杆菌的特异性。

1.3.5 HDA法检测靶标菌株的产物分析

将提取后葡萄糖杆菌基因组DNA加入到1.3.3节建立的反应体系中，HDA法扩增后，进行2%琼脂糖凝胶电泳。回收凝胶产物的目的条带并纯化，送测序公司进行测序，将测序结果在NCBI上进行在线BLAST，比较扩增产物的同源性。

1.3.6 HDA法检测葡萄糖杆菌的检出限

经过计数实验证实发酵乳中不含葡萄糖杆菌，分别将葡萄糖杆菌人工添加到该批次发酵乳中，使其菌数依次为100～107CFU/g，按照1.3.1节方法进行发酵乳中葡萄糖杆菌基因组DNA的提取，得出检出限。

1.3.7 实际样品HDA法检测

通过本研究建立的HDA法对市售发酵乳进行实际检测。

2 结果与分析

2.1 HDA法反应体系优化结果

由图1～2可知，当50 μL反应体系中UvrD解旋酶添加量为0.10 μg、T4 gp32添加量为5.0 μg时，电泳条带明亮清晰，无扩散现象，表明在该添加量下葡萄糖杆菌HDA法检测效果良好。

2.2 葡萄糖杆菌HDA法检测特异性

由图3可知：3 株葡糖杆菌均有单一的扩增条带产生，长度大约为309 bp，与目的片段大小一致；其他15 株菌均无扩增现象。因此，可以说明本研究建立的HDA法用于葡糖杆菌检测的特异性较好。

2.3 HDA法检测葡萄糖杆菌的产物分析结果

表 3 葡萄糖杆菌产物比对结果Table 3 Results of sequence alignment of amplification products from Gluconobacter

使用HDA法靶向ITS基因检测葡萄糖杆菌的扩增产物同源性为100%。在线比对结果见表3，证明HDA法检测葡萄糖杆菌的扩增产物均为目的扩增产物，符合检测需要。

2.4 葡萄糖杆菌HDA法测定检出限

由图5可知，发酵乳中葡萄糖杆菌HDA法的检出限为4.3×101CFU/g，该检出限能够满足方法的现场检测需求，保证了该方法推广的可行性。

2.5 实际样品检测结果

利用建立的方法检测200 批次市售发酵乳样品，有19 批次样品检测结果为阳性，181 批次的样品检测结果为阴性，约10%市售发酵乳中含有葡萄糖杆菌，情况较为严重，虽对消费者健康影响不大，但是对产品质量和品牌形象会造成很大损害。

3 结 论

HDA法用于葡萄糖杆菌检测有其自身优势。首先，相比于其他需要变温的基因扩增方法，该方法不需要专用设备，仅需要恒温水浴或金属浴就能够满足，一般实验室就能够实现，且便于现场采样检测使用；其次，相比于其他几种恒温检测技术，HDA法在引物设计和筛选上与普通PCR相同，避免了引物错配，降低了假阳性率[17-18]。这都保证了HDA技术在基层监管部门、生产企业良好的应用前景，结合本研究在直观检测方面的研究结果，为该技术的适用性提供了更广阔的使用空间，也符合我国高新技术产业的发展要求。

本研究根据葡萄糖杆菌的ITS基因序列设计引物，通过HDA法直接检测发酵乳中的葡萄糖杆菌，对扩增产物进行电泳检测，建立快速、准确检测发酵乳中葡萄糖杆菌的HDA方法，确定该方法在50 μL反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的较适添加量分别为0.10 μg和5.0 μg，反应条件为：65 ℃恒温2 h。该方法检测特异性好、无非特异性扩增，经测序比对，葡萄糖杆菌的同源性为100%，检出限为4.3×101CFU/g。该方法检出限低、特异性强、检测所需时间短，这对于监控生产过程污染菌葡萄糖杆菌的菌数尤为重要，也为进一步保证发酵乳的食品安全提供了新方法。