肺腺癌骨转移癌痛患者外周血转录组学研究

林中原 王益敏 张辉 林世清 刘德成 唐可京 张朝晖 窦云凌

中山大学附属第一医院1麻醉科，3呼吸与危重症医学科（广州510080）；2广东省第二人民医院麻醉科（广州510317）

肺癌骨转移好发于脊柱和躯干骨近端，约50%肺癌骨转移患者可出现骨癌痛，且随着病情逐渐加重，严重影响患者情绪、睡眠和日常生活能力［1］。骨转移癌痛（metastatic bone pain，MBP）作为一种难治性癌痛，包括静息时持续性疼痛、静息时自发或运动时诱发的爆发痛。尽管目前已有双磷酸盐、核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）的单克隆抗体等骨改良药物的广泛应用，但是骨转移癌痛的发生率仍居高不下，其原因是发生发展机制尚未完全阐明。目前，针对骨转移癌痛的机制研究多集中于动物模型，而行为学实验难以全面、准确评估骨转移癌痛的疼痛特点。RNA-seq技术是利用第二代高通量测序技术对转录组进行研究的方法，能够针对特定组织或细胞的所有差异表达基因、基因变异等进行研究，从而识别与疾病发生发展密切相关的核心基因。该技术在肺癌的分子病因学研究中取得了一系列的成果［2］，然而针对肺癌骨转移癌痛的研究较少。本研究拟通过选择典型肺腺癌骨转移癌痛患者，利用RNA-seq技术筛选与骨转移癌痛发生发展密切相关的关键基因，并采用生物信息学方法对其进行生物功能和生存分析研究，为临床治疗骨转移癌痛提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究经中山大学附属第一医院伦理委员会批准，并与患者签署知情同意书。选择我院2019年8月至2020年3月肺腺癌骨转移患者11例，其中符合典型骨转移癌痛临床表现且疼痛视觉模拟评分（VAS）4分者作为骨转移癌痛组（MBP组，n = 5），VAS评分为0分者作为对照组（C组，n = 6）。本研究中典型骨转移癌痛患者临床表现需满足静息时持续性疼痛、静息时自发性爆发痛或运动时诱发性的爆发痛，且病程大于1个月。纳入标准：年满18岁；组织学或细胞学明确诊断为肺腺癌者；脊柱部位骨病变活检为肺癌转移/具备典型的骨转移影像学表现者，即局限病灶需MRI/PET-CT/骨组织活检确诊，广泛病灶需PET-CT/CT/X线/MR确诊。排除标准：近1个月内对肿瘤部位或疼痛部位使用放射治疗者，非癌性痛或非骨转移部位引起疼痛者，明显肝肾功能不全者，合并急/慢性感染性疾病，不能准确描述疼痛部位及进行疼痛评分者。每位受检者用PAX gene管抽取外周血5 mL，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 RNA 提取、文库构建及测序采用1%琼脂糖凝胶进行RNA降解和污染监测。利用Agilent4200 TapeStation（Agilent technologies，CA，美国）系统检测RNA完整性，采用带有Oligo（dT）的磁珠对具有polyA结构的mRNA进行捕获并形成1stcDNA，再进行PCR扩增，纯化扩增产物：包括DNA片段化处理、末端修复、加碱基A、加接头以及PCR扩增和文库质控等，最终建成文库。接着对文库进行Illumina PE150测序，根据Illumina HiSeqTM 2500平台测序获得原始数据（raw reads），经过去除低质量序列、去接头污染等数据过滤过程得到高质量的序列（clean reads）。利用RPKM（reads per kilobase of exon model per million mapped reads）值衡量基因的表达量。

1.3 差异表达基因筛选使用R软件DEseq2［3］包对上述RNA-seq数据进行标准化并筛选差异表达基因（differentially expressed gene，DEGs）。本研究中如基因符合以下标准，则该基因被认为是DEGs：DEseq2中的错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05；log2差异倍数（fold change，FC）＜-1或log2 FC ＞1。使用ggplot2软件包在R软件中绘制火山图。

1.4 通路与功能富集分析将DEGs导入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）在线分析网站进行GO（geneontology，GO）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）功能富集分析，分析其中涉及骨转移癌痛的相关通路，以P.adjust ＜0.05为阈值筛选差异表达基因的富集分析结果。

1.5 蛋白相互作用网络分析将DEGs导入STRING（https：//string-db.org/）在线分析网站进行蛋白质互相作用网络分析（protein-protein interaction，PPI）。利用Cytoscape软件对上述PPI结果进行可视化，并使用插件MCODE筛选出关键蛋白表达模块及与骨转移癌痛密切相关的基因，设置参数：Degree 6，K-core 2，NodeScore Cutoff 0.2及Max.Depth=100作为筛选标准。

1.6 生存分析将关键蛋白表达模块内的基因导入GEPIA工具（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）［4］，根据TCGA数据库中肺腺癌患者临床随访信息，包括生存状态和总生存时间和，绘制Kaplan-Meier生存曲线，并进行log-rank统计检验；计算风险比（hazard ratio，HR），分析关键节点基因的预后关系，P ＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达基因的筛选对比两组基因表达差异，基于标准（|log FC|＞1 and P ＜0.05），找到2332个DEGs，其中上调基因1647个，下调基因685个。并利用ggplot2软件包在R中绘制火山图（图1）。

图1 差异表达基因火山图Fig.1 Volcano Map of differentially expressed genes

2.2 差异基因的通路与功能富集分析将DEGs导入DAVID数据库中进行GO功能分析与KEGG通路富集分析，并按照P值从小到大展示前十位的GO条目（表1、图2）及所有的KEGG富集通路（表2、图3）。结果显示差异基因主要功能富集表达于趋化因子信号传导、p53信号通路、ECM受体相互作用等通路。

表1 前10 的GO 富集分析结果Tab.1 Top 10 GO enrichment analysis result

表2 KEGG 通路富集分析结果Tab.2 KEGG pathways enrichment analysis result

2.3 蛋白互作网络分析及关键基因筛选将差异表达基因导入STRING在线分析网站进行蛋白互作网络分析，利用Cytoscape软件的MCODE插件对结果进行可视化分析并筛选出PPI网络中重点蛋白表达模块，设置参数：Degree 6，NodeScore Cutoff 0.2，K-core 2及Max.Depth=100作为筛选标准，得到1个与骨转移癌痛密切相关的蛋白表达模块及4个关键基因（图4）。

图2 GO 富集分析结果Fig.2 GO enrichment analysis

图3 KEGG 富集分析结果Fig.3 KEGG enrichment analysis

图4 重点蛋白表达模块Fig.4 The key protein expression module

2.4 生存分析为了探究模块内20个关键节点基因与肺腺癌的预后关系，利用TCGA随访数据结合关键节点基因表达值进行生存分析，分析结果发现与GNG7高表达患者相比，肺腺癌患者中低表达GNG7患者生存率明显降低（P ＜0.05）。见图5。

3 讨论

肺癌的发病率及死亡率居全国首位，其发生骨转移的概率高达10% ～15%，腺癌是其中最常见的病理类型［5］，骨转移癌痛是癌症中晚期患者经常面临的十分重要的问题，严重影响这类患者的生存质量。传统动物实验主要通过胫骨或股骨注入肺肿瘤细胞获得骨转移癌痛模型，不足以反映肺癌骨转移癌痛患者疼痛的发生发展机制。

图5 GNG7 生存曲线Fig.5 Survival curve evaluating the prognostic value of GNG7

本研究发现在肺腺癌骨转移癌痛患者外周血细胞中CXCL1、CXCL10、CXCR4基因表达显著上调。同时，在GO和KEGG功能富集分析中也发现了众多基因在趋化因子信号传导等炎性通路上显著富集。既往研究表明，CXCL1和CXCL 10可诱发骨转移癌痛大鼠痛觉过敏，使用受体拮抗剂或中和抗体抑制趋化因子信号通路，能够有效减轻疼痛程度［6］。另外有证据表明趋化因子表达上调可以减弱阿片类药物的镇痛作用，大鼠脊髓鞘内注射CXCL 10可减弱吗啡的镇痛作用［7］，这可能为治疗癌性爆发痛提供新思路。CXCR4是CXCL12的主要受体，多表达于脊髓神经元和胶质细胞［8］。SHEN等［8］研究显示骨转移癌痛大鼠脊髓组织中CXCL12和CXCR4表达水平升高，并且可以通过致敏神经元、激活星形胶质细胞和小胶质细胞促进骨转移癌痛的发展。近期研究进一步明确了脊髓神经元中的CXCR4可以通过下游CaMKII/CREB通路诱导骨转移癌痛大鼠痛觉敏化［9］。综上所述，CXCL1、CXCL10和CXCR4可能参与了肺癌骨转移灶肿瘤微环境的形成，并且可能通过诱导中枢敏化促进癌性爆发痛发生，这些都为骨转移癌痛的临床治疗提供理论依据。

进一步对关键蛋白表达模块内的20个基因进行生存分析，结果表明低表达GNG7的肺腺癌患者生存率明显降低（P ＜0.05）。文献报道，GNG7（G蛋白γ7亚基）广泛表达于各种组织，但在多种肿瘤细胞如胰腺癌、胃癌、食管癌等细胞中低表达［10］。GNG7既可以通过抑制mTOR通路介导的细胞自噬和凋亡，也可以通过调节肌动蛋白细胞骨架抑制细胞分裂［10］，提示骨转移癌痛的发生可能与GNG7的抗肿瘤作用减弱有关。另外，非癌性痛患者中GNG7也显示出与疼痛发生的明显相关性。NICULESCU等［11］研究提示GNG7可能作为一种疼痛抑制基因，在阿尔兹海默症并重度疼痛状态患者的血液中明显低表达。同时，作者通过长期随访进一步证实GNG7是阿尔兹海默症患者发生重度疼痛的强预测因子［11］。另有证据表明疼痛相关疾病如糖尿病周围神经病变及椎间盘突出患者中也出现了GNG7基因的明显差异表达［12-13］。基于以上研究，推测GNG7作为抑癌基因延缓肺腺癌骨转移的发生发展。同时，GNG7与多种疼痛疾病的发生密切相关，可能成为骨转移癌痛发生的重要预测因子。

本研究差异基因功能富集分析结果显示趋化因子信号通路和p53信号转导通路在两组患者出现表达差异，再次表明趋化因子的高表达与骨转移癌痛发生关系密切。P53信号通路是多种肿瘤发生中最常见的突变通路，在前列腺癌小鼠模型中，P53突变细胞群体对骨的亲和力更高，容易诱导成骨细胞的形成而发生骨转移［14］。文献报道，晚期肺癌表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）敏感突变患者易携带P53基因产生共突变，该亚克隆共突变事件促进肿瘤的转移并极大地影响EGFR-TKI的疗效［15-16］。而骨转移患者肺原发灶与骨转移灶EGFR和P53共突变高度一致［15］，表明EGFR和P53共突变可能是驱动肺癌细胞发生骨转移的起始基因。另外，体外肺癌细胞实验证明，功能获得性P53基因表达能够促进EGFR信号通路的表达，而EGFR的表达又可以反式激活P53［17］。因此，P53和EGFR的共突变可能是驱动肺癌细胞骨转移的关键。

本研究不足之处在于尚未对肺腺癌患者的个体差异和疾病特质性进行分类，且未对疼痛程度进行分层分析，同时没有开展细胞或动物实验验证上述结论，后期将进一步探讨。

综上所述，本研究通过转录组学相关方法，证明趋化因子/趋化因子受体CXCL1、CXCL10、CXCR4与GNG7参与了骨转移癌痛的形成，其中趋化因子信号传导通路和p53信号通路可能是肺腺癌骨转移癌痛发生的重要机制，为临床治疗肺腺癌骨转移疼痛提供了重要预测因子和治疗靶点。