活血定喘汤对支气管哮喘患儿气道炎症及炎性因子水平的影响*

石义兵，郭小龙

1.鄂东医疗集团黄石市妇幼保健院儿科(黄石 435000)；2.陕西省延安市人民医院(延安 716000)

哮喘(Bronchial asthma，BA) 是由中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等多种细胞及细胞因子共同参与的一种气道慢性炎症，具有一定遗传倾向，主要以呼吸道黏液分泌量增加、气道重构和气道高反应性为重要病理特征[1]。目前支气管哮喘发病逐渐呈现年轻化和上升趋势，据流行病调查结果显示我国城市14岁以下儿童哮喘患病率已由1990年的1.09%上升为3.02%[2]。临床上将哮喘分为急性发作期、持续期和缓解期3个阶段，患者发作期常伴有咳嗽、发热和咯痰等临床病症，大多数患者可自行缓解，若发生严重急性发作，救治不及时会威胁患者生命[3]。中医认为哮喘主要由接触异物以及外感风邪导致机体痰饮留滞、脾肺肾功能虚亏，从而诱发哮喘，近年来中医治疗哮喘已取得较大成效[4]。活血定喘汤是由麦冬、沙参、白术、黄芪、杜仲等多味中药材组成的一种方剂，具有止咳平喘、活血化瘀、补脾益气之功效。1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate，S1P)属于鞘磷脂代谢产物之一，主要由巨噬细胞和肥大细胞产生。S1P是一种重要的炎性介质，众多研究报道了S1P在哮喘发作时对于气道重构的重要作用，一定程度上可反映哮喘气道炎症情况[5]。磷脂酞肌醇3激酶(Phospholipid inositol 3 kinase，PI3K)属于生长因子超受体家族重要成员之一，具有促进支气管平滑肌增生作用，众多研究报道了PI3K/AKT信号通路在类风湿性关节炎炎症性疾病和哮喘等炎症性疾病中的作用[6]。本研究采用自拟活血定喘汤治疗儿童支气管哮喘，观察临床效果，并探讨其对外周血PI3K和血清S1P水平的影响。

资料与方法

1 一般资料 研究对象为2016年1月至2018年12月期间我院收治的98例患儿，均诊断为支气管哮喘，年龄介于4～14岁间，将其随机分为研究组和对照组各49例。对照组口服孟鲁司特钠片治疗，研究组在对照组基础上联合加用活血定喘汤治疗。诊断标准：《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》[7]。病例纳入标准：①所有患儿均为年龄 4～14岁的中国儿童；②均诊断为慢性缓解期支气管哮喘，且所有患儿的哮喘病情严重程度属于1级或2 级；③患儿能耐受研究中相应的治疗药物。排除标准：①严重呼吸功能不全者或曾患有呼吸功能衰竭进行机械通气者；②近13个月因呼吸系统疾病而接受治疗者；③入组前1个月内接受过全身性糖皮质激素治疗且超过1周者或入组前3 d内接受全身性茶碱类制剂或糖皮质激素治疗；④有严重精神疾病者、同时患有严重呼吸道感染、自身免疫或造血系统疾病以及严重心肾功能不全者；⑤对治疗药物过敏者。

两组患儿的基础资料、性别、年龄和体重，以及病情等比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究通过我院伦理委员会审批，且所有纳入患儿均经父母或监护人充分知情并签署书面文件。

表1 两组患儿基础资料比较

2 治疗方法

2.1 对照组：口服孟鲁司特钠片(国药准字H200

64370，规格：5 mg/片)，5 mg/次，1次/d，治疗时间为3个月。

2.2 研究组：在对照组基础上，加用活血定喘汤，组方：麦冬20 g，沙参、黄芩、黄芪、山萸肉各15 g，白术、杜仲、陈皮、红花、桃仁各12 g，法半夏10 g，麻黄、杏仁各8 g，甘草6 g，加水煎至300 ml，分早晚2次温服，每日1剂，疗程为3个月。

3 观察指标

3.1 两组患者治疗后肺功能改善情况比较：于治疗前和治疗3个月后采用肺功能检测仪(型号：BTL-08 SPIRO)检测所有患儿肺功能因子，包括用力肺活量(FVC)和第1秒用力呼气流量(FEV1)。

3.2 两组患者血清炎症因子以及S1P表达水平比较：分别于治疗前和治疗第3个月清晨，空腹采血3 ml于肝素抗凝管中，使用高速离心机(美国贝克曼库尔特生产)15000 r/min离心15 min分离血清后，严格按照操作说明，使用FX-6MG酶联免疫光谱分析仪并采用ELISA法(酶联免疫吸附)对患儿的血清IL-13和IL-4，IFN-γ和S1P表达水平进行检测，并制作相应标准曲线。ELISA试剂盒购自上海通蔚实业有限公司。

3.3 两组患儿外周血单个核细胞中PI3K mRNA相对表达量比较：①分别于治疗前和治疗第3个月清晨，空腹采血5 ml于肝素抗凝管中，采用Ficoll密度梯度离心法提取并分离出外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。②在PBMC中加入TRlzol试剂液裂解细胞，使用定量RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)法测定PBMC中PBK mRNA的表达，将获取的RNA溶解于20 μl无菌DEPC水中，并通过A260/280A和10 g/L琼脂糖凝胶电泳确定RNA质量，取比值1.8以上和出现两条及以上带的RNA进行引物设计。并采用相对定量法确定PI3K mRNA的定量，每组重复测定3次确定RT-PCR半定量结果，并取3次测定平均值作为统计用均数。

3.4 两组患儿免疫细胞水平比较：使用全自动变应原体外检测仪测定所有患者ECP、IgE水平；采用嗜酸粒细胞稀释液检测EOS：将血液进行定量稀释并破坏血液中白细胞和红细胞，将嗜酸性粒细胞颗粒染色后滴入计数室，计算一定范围内的嗜酸性细胞数，然后换算成每升血液中的嗜酸性粒细胞数，严格按照试剂盒说明书和仪器操作规程进行操作和质量控制；血清中T细胞亚群CD4+、CD8+含量：分别于治疗前和治疗第3个月的早晨，空腹条件下采集患儿3 ml血液，并以带有肝素为抗凝剂的采集管中，经处理获取淋巴细胞，之后采用流式细胞仪测定CD4+、CD8+含量，并计算CD4+/CD8+值。

3.5 不良反应：记录所有患儿治疗期间的不良反应发生情况，计算并比较两组患儿不良反应发生率。

4 疗效标准 比较两组患者治疗疗效[8]。分别于治疗3个月时比较两组患者治疗效果。显效：基本无临床症状，哮喘偶尔发作不服药也可自行缓解，患儿非发作期FEV1增加量为25%～35%；有效：临床症状部分缓解，哮喘发作次数明显减少，患儿非发作期FEV1增加量为10%～24%；无效：不满足有效标准甚至病情加重者，且患儿非发作期FEV1增量低于10%甚至出现负增长。治疗有效率=(显效+有效)例数/总例数×100%。另外分别于治疗前后采用儿童哮喘控制测试问卷(C-ACT) 对所有患儿的C-ACT评分进行调查。

结 果

1 两组患儿治疗前后肺功能比较 见表2。治疗前两组患儿FEV1、FEV1/FVC、C-ACT评分无统计学差异，治疗后同组患儿FEV1和FEV1/FVC、C-ACT评分均显著高于治疗前(P<0.05)，且研究组相对对照组具有更大的改善幅度。

表2 两组患儿治疗前后FEV1、FEV1/FVC 与C-ACT评分比较

2 两组患儿临床治疗效果比较 见表3。两组患儿治疗的有效率差异具有统计学意义(P<0.05)，研究组为89.80%，明显高于对照组的65.31%。

表3 两组患儿临床治疗效果比较[例(%)]

3 两组患儿治疗前后血清中炎症相关因子、PI3K及S1P浓度比较 见表4。经3个月治疗，两组患儿的IL-4、IL-13、LXA4水平以及PI3K的mRNA相对表达量相比治疗前均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而INF-γ水平则显著高于治疗前，且跟对照组相比，研究组表现出更大幅度的改善，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 两组患儿治疗前后血清IL-4、IL-13、INF-γ及PI3K、S1P水平比较

4 两组患儿治疗前后免疫细胞水平比较 见表5。治疗前两组患儿的免疫细胞水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后，同组患者血清ECP、EOS、IgE水平以及CD8+相比治疗前均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，CD4+以及CD4+/ CD8+均显著高于治疗前，且研究组较对照组具有更好的改善效果，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表5 两组患儿血清ECP、EOS、IgE及CD4+、CD8+水平比较

5 两组患儿治疗期间不良反应发生情况比较 治疗期间，研究组患儿较对照组并未出现不良反应的增加(P>0.05)，见表6。

表6 两组患儿治疗期间不良反应发生情况比较[例(%)]

讨 论

支气管哮喘是临床常见的一种由气道非特异性炎性反应导致的呼吸系统疾病，哮喘发作时，患者常伴有胸闷、气促、喘息和咳嗽等症状。支气管哮喘的发生与空气污染、遗传以及环境等因素存在密切联系，但临床上尚未完全揭示急性支气管哮喘发病的分子生物学机制。儿童支气管哮喘常表现为呼吸紧促、咳喘且伴有明显哮鸣音，严重者甚至口唇青紫、抬肩张口。近年来中医药在哮喘的治疗上已取得重要进展，中医认为该哮喘的病理变化是体内积有“伏痰”，遇感引触后导致痰随气升，但由于伏痰阻气，二者相互搏结导致气道壅塞狭窄，肺气宣降发生失常，从而进一步导致气喘咳痰以及哮鸣[9]。哮喘的根本病因在于肺部，但随着反复发作和病程久远，会累及脾肾。同时肺功能与机体血液运行及生成关系紧密，当存在肺功能障碍时会导致血液瘀滞，而血瘀气阻在哮喘发作过程中具有关键作用[10]。另外大量研究已经证实哮喘的发生发展过程中常伴随着免疫及炎性状态的失衡，因此目前临床上治疗哮喘的重要目标均是尽可能减轻患者气道炎症和改善患者临床症状[11-12]。

PI3K是细胞内信号蛋白总称，广泛表达于气道平滑肌和气道上皮，可以促进支气管平滑肌增生。支气管哮喘是一种气道非特异性慢性炎性反应，哮喘发作时，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等多种细胞和细胞因子会在气道大量聚集并释放炎症因子，诱发气道炎症反应[6]。Panek等[13]研究报道PI3K/AKT信号通路可以加重气道炎症反应、提高气道高反应性、上调Th2等细胞因子水平和增加黏液分泌量，且PI3K/AKT 信号通路除了对炎症细胞产生影响外，还具有调节哮喘炎症基因表达的作用。Jiang等[14]研究也证实 PI3K 抑制剂能明显减轻过敏原诱导的小鼠气道炎症。另有研究表明哮喘患者肺部巨噬细胞和上皮细胞中骨桥蛋白表达水平明显升高，其将激活PI3K/AKT及其下游信号通路，导致基质金属蛋白酶MMP-9和炎性因子IL-13的表达水平大大提高，从而导致气道黏液分泌增多、反应性加重。前人研究均说明了PI3K/AKT通路在哮喘发病过程发挥重要作用且其与哮喘发病程度存在密切联系。在本研究中，研究组和对照组患者在接受治疗后，同组患者PI3K的mRNA相对表达量、血清炎性因子IL-4、IL-13水平、免疫细胞因子ECP、EOS、IgE水平以及CD8+相比治疗前均显著降低，INF-γ水平、CD4+/ CD8+均显著高于治疗前，且研究组较对照组具有更大的改善幅度。磷酸鞘氨醇属于鞘磷脂代谢产物之一，主要由巨噬细胞和肥大细胞产生，其不仅参与细胞生长、增殖、分化等重要生物学过程，也是一种重要的炎性介质，在哮喘的发病机制中发挥重要作用，一定程度上可反映哮喘气道炎症情况[5]。SIP主要通过诱导肥大细胞活化脱颗粒以及诱导形成应力纤维，导致气道炎症反应和促进气道纤维细胞生长，最终引起气道高反应性和气道重构[15]。Feuerborn等[16]研究报道急性期哮喘患儿血清S1P水平显著高于健康儿童，本文研究结果显示非急性期哮喘患儿S1P水平显著高于对照组，提示急性和非急性哮喘发作时，患者气道均存在炎症。活血定喘汤是由多味中药材组成的具有止咳平喘、益气健脾、活血化瘀功效方剂。方中麻黄、杏仁具有止咳平喘、宣肺效果；沙参和麦冬具有补肺滋阴之功效；白术和黄芪可以健脾益气；另外方中杜仲、山萸肉等具有纳气补肾作用；半夏和陈皮可以化痰、理气；另外方中加有桃仁、红花等活血化瘀，可以祛瘀散结通络。另外现代许多药理研究结果证实红花具有增强超氧化物歧化酶(SOD)活性和清除炎性因子，作用，可以有效改善机体的炎性水肿状态及气道反应性[17]。金香等[18]通过动物研究发现麻黄可以通过降低IL-13等炎性因子的表达水平改善支气管哮喘模型小鼠的气道炎症反应程度。本文结果显示在常规西药治疗基础上服用活血定喘汤药，研究组患儿治疗疗效更佳，且相较对照组并未出现不良反应率的增加，表明该中西结合疗法不仅可以显著提升哮喘患儿的临床治疗效果，且不会增加明显不良反应。另外本文研究结果显示研究组患儿治疗后其肺功能指标、血清炎症因子及PI3K、S1P水平以及免疫指标相比对照组均得到明显改善。我们认为活血定喘汤可以改善哮喘患儿机体炎症反应和免疫状况，可能是通过抑制PI3K/AKT通路，降低外周血PI3K、S1P表达量，从而减轻了气道炎症反应，降低了相关炎性因子的表达水平。另外黄芪除具有明显抗氧化应激、抗炎作用外，还可以通过改善机体Th1/Th2淋巴亚群的平衡，发挥免疫调节作用。同时甘草也可以通过调节STAT-6信号通路，减少IL-17等炎性的合成和表达，从而改善机体免疫功能。活血定喘汤中诸药协同奏效，共同发挥平喘、止咳、宣肺散瘀之效。

综上，活血定喘汤治疗儿童支气管哮喘的临床疗效显著，可改善患儿体内血清炎症因子、PI3K以及 S1P水平，增强患儿肺功能和免疫功能。