益脾养肝方对大鼠肝癌癌前病变miR-221表达的影响*

边 倩,曹 妮,刘 航 ,李京涛 ,魏海梁,闫曙光 ,郭英君

1.陕西中医药大学附属医院(咸阳 712021)；2.陕西中医药大学(咸阳 712046)；3.宁夏回族自治区人民医院(银川 750001)

肝硬化逐渐发展至肝癌这一病理过程中需经历肝癌癌前病变，肝部肿瘤细胞的异常增生是肝癌发生发展的主要病理因素[1]。微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA。这些非编码RNA在转录后水平上调节靶基因的表达，从细胞的发育和分化到癌症，miRNA均有广泛参与[2]。miR-221在肝癌组织与细胞中表达上调，表明其可能参与了肝癌发展的过程，检测miR-221的表达对于该病的诊断以及病情提示或存在重要意义[3]。益脾养肝方是陕西省名中医常占杰教授防治肝癌癌前病变的方药[4]。本实验采用DEN诱导大鼠肝癌癌前病变模型，探讨益脾养肝方对模型大鼠miR-221表达水平的影响，具体研究与结果分析如下。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物：180只SPF级大鼠，体重为100～120 g，购自西安交通大学医学部实验动物中心，许可证号SCXK(陕)2012-003。所有大鼠于陕西中医药大学实验中心分笼饲养，喂养标准大鼠饲料，自由摄入食水，室温(23±2)℃，相对湿度(50±5)%，光照：12 h明暗交替。适应性饲养1周后进入实验。

1.2 药品与试剂：益脾养肝方组方包括：党参、白术、白花蛇舌草各30 g；枸杞子、鳖甲、半枝莲各15 g；熟地黄、姜黄、郁金各10 g，购自陕西中医药大学附属医院药剂科，将组方制成冻干粉低温保存。使用时设置浓度分别为1.2、0.6、0.3 g/ml。

其他药品试剂及产地批号：护肝片，国药准字Z20003336；苏木素，Sigma(H9627)；伊红(水溶性)，国药集团(71014544)；二甲苯，国药集团(10023418)；TUNEL细胞凋亡试剂盒，上海翊圣生物科技有限公司(40308ES20)；蛋白酶K(Proteinase K)，武汉华美生物工程有限公司(CSB-DP437A)；4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)，碧云天(C1002)；抗荧光淬灭封片，北京百奥莱博科技有限公司(0100-01)；Trizol试剂盒，上海名劲生物科技有限公司(Lot:252250AX)；五倍缓冲液，郑州乐瑞生物有限公司(R101-01/02)；赛博绿实时多聚酶链反应混合液(SYBR Green Master Mix)，上海恒斐生物科技有限公司(Q111-02)。

1.3 主要仪器与设备：病理切片机，德国Leica RM 2016轮转式切片机；显微镜，奥林巴斯BX53型生物显微镜；实时荧光定量PCR仪，ABI(Quant Studio 6)；微量分光光度计，杭州奥盛仪器有限公司(Nano-100)；电热恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表有限公司(HW-SY11-K P2)；电泳仪，北京海天友诚科技有限公司(DYCZ-25D)；紫外分析仪，上海路阳仪器有限公司(LUV-270A)。

2 实验方法

2.1 动物分组、造模、给药及取材：将180只大鼠随机分为六组：空白组、模型组、护肝片组及益脾养肝方高、中、低剂量组，每组30只。除空白组外，其余各组均以0.5 ml/100 g 的二乙基亚硝胺腹腔注射，每周50 mg/kg(2次/周，即1次/84 h)，连续给药16周；空白组：给予同等条件的饲养与抓捕，同等时间点注射等量生理盐水。造模次日起中药高、中、低剂量组分别给予浓度为1.2、0.6、0.3 g/ml的益脾养肝方药液灌胃，护肝片组按1 g/ml大鼠体重灌胃，空白组、模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃。灌胃持续16周，1次/d。

待实验周期结束，全部大鼠用10%的水合氯醛行腹腔注射(0.3 ml/100 g)，待大鼠麻醉后解剖腹腔，腹主动脉取血，3000 r/min离心15 min，分离血清，置于-20 ℃冰箱备用；同时取各组大鼠肝脏组织，取部分肝组织放入4%多聚甲醛中，4 ℃固定过夜后制作石蜡切片及HE染色，其余肝组织置于-80 ℃冰箱备用。

2.2 制作组织病理片：将固定后的肝组织用酒精梯度脱水，石蜡包埋，4 μm切片，常规HE染色，光镜下观察并拍照。

2.3 肝细胞凋亡的检测：先用PBS润洗脱蜡后的病理切片，再用PBS稀释2 mg/ml的Proteinase K溶液，使其终浓度为20 μg/ml。在每个样本上滴加100 μl的Proteinase K溶液，37 ℃孵育20 min。再用PBS润洗样本，去掉多余液体。按1∶5的比例用去离子水稀释缓冲液。每个样本滴加100 μl 缓冲液使其覆盖样本，37 ℃孵育10 min。之后在组织上加入TdT孵育缓冲液，勿让组织干片。将盖玻片盖在组织上，载玻片置于湿盒内室温孵育60 min，PBS反复洗涤后，添加DAPI继续孵育5 min，染核后使用PBST 冲洗去除多余DAPI，使用含抗荧光淬灭剂封片液进行封片后荧光显微镜下观察大鼠肝细胞凋亡图。

2.4 实时荧光定量PCR检测miR-221表达量：取出各组大鼠肝组织，采用Trilzol法提取总RNA，采用微量分光计测定RNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳对RNA的完整性进行检测。根据逆转录试剂盒的说明进行逆转录操作，以U6为内参，在表1所示的引物条件下进行miR-221表达的检测。miR-221引物序列合成后在PCR仪上进行实时定量反应,以2-△△Ct法来计算miR-221的相对表达量，实验重复3次以校正最终结果，见表1。

表1 rno-miR-221引物序列表

3 统计学方法 运用SPSS 22.0统计学软件进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间均值比较采用单因素方差分析，两两比较行LSD检验，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠一般情况比较 空白组大鼠的毛色光亮，形体适中，动作行为敏捷，进食水情况正常且未出现死亡。其他组大鼠实验7周后，食量明显减少，毛色晦暗，动作反应迟缓，益脾养肝方高剂量组和护肝片组上述症状有所改善，模型组和益脾养肝方低剂量组大鼠各死亡1只。

2 各组大鼠肝组织形态学变化情况比较 空白组大鼠的肝组织结构未发生破坏，窦间隙正常，细胞核大小正常，其余各组肝组织结构均受到破坏，且有异型性增生细胞紧密排列，肝细胞胞质水肿，模型组及益脾养肝方中、低剂量组表现更为明显，且模型组及益脾养肝方中、低剂量组可见多核细胞，部分胞核体积成倍增大，窦间隙消失，能够观察到较为明显的淋巴以及炎性浸润(图1)。

3 各组大鼠肝细胞凋亡情况比较 空白组几乎无红染的凋亡细胞显示，其余各组均可见因细胞膜通透性改变导致水肿，体积增大的凋亡肝细胞(图2)。六组肝细胞凋亡阳性细胞数差异具有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，其余各组肝细胞凋亡阳性细胞数均升高(P<0.05)；与模型组比较，护肝片组及益脾养肝方中、高剂量组肝细胞凋亡阳性细胞数均降低(P<0.05)；与护肝片组比较，益脾养肝方低、中剂量组肝细胞凋亡阳性细胞数均升高(P<0.05)，且护肝片组与益脾养肝方高剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；益脾养肝方各剂量组之间比较，高剂量组肝细胞凋亡阳性细胞数均低于低、中剂量组(P<0.05)，且中剂量组低于低剂量组(P<0.05)。见表2。

4 各组大鼠肝组织miR-221表达水平比较 见表3。六组肝组织miR-221相对表达量比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，其余各组miR-221相对表达量均升高(P<0.05)；与模型组比较，护肝片组及益脾养肝方低、中、高剂量组miR-221相对表达量降低(P<0.05)；与护肝片组比较，益脾养肝方低、中、高剂量组miR-221相对表达量均升高(P<0.05)；益脾养肝方各剂量组之间比较，高剂量组miR-221相对表达量均低于低、中剂量组(P<0.05)，且益脾养肝方中剂量组低于低剂量组(P<0.05)。

A：空白组；B：模型组；C：护肝片组；D：益脾养肝方低剂量组；E：益脾养肝方中剂量组；F：益脾养肝方高剂量组 图1 各组大鼠肝细胞凋亡表达，胞核呈红色荧光(HE染色，×200)

A：空白组；B：模型组；C：护肝片组；D：益脾养肝方低剂量组；E：益脾养肝方中剂量组；F：益脾养肝方高剂量组 图2 各组大鼠肝细胞凋亡表达，胞核呈红色荧光(免疫荧光染色，×400)

表3 各组大鼠肝组织miR-221相对表达量比较

讨 论

肝脏组织在形成完整的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma cancer，HCC)之前会经历一个“肝炎-肝硬化-肝癌”过程[5]，而在肝硬化到肝癌之间会出现一个复杂且漫长的癌前病变阶段，对该阶段的干预或治疗与祖国医学中的“治未病”理念不谋而合。肝积、肥气、臌胀、积聚、黄疸以及肺积在中医归属于肝癌疾病范畴，原发性肝癌中医辨证分型主要体现为气滞血瘀型、肝郁脾虚型、肝肾阴虚型、肝郁气滞型以及脾胃气虚型等方面[6]。益脾养肝方有活血行气、益脾养肝以及消肿散结等功效。刘亚珠等[7]研究发现益脾养肝方对于大鼠肝癌癌前病变具有抑制作用，其作用可能与抗细胞异常增殖和抗细胞氧化损伤有关。李福广等[8]认为益脾养肝组方之一的姜黄可以抑制肝细胞癌相关肝星状细胞的增殖，并降低其侵袭能力。本研究结果显示，高剂量的益脾养肝方与护肝片具有相似的作用，两组对抑制肝癌发生具有积极作用。在检测肝细胞凋亡情况时发现，建模各组细胞凋亡能力均有不同程度的升高，而护肝片组和高剂量益脾养肝方治疗的大鼠细胞凋亡数有所下降，中剂量的益脾养肝方次之，结果表明了护肝片组及中、高剂量的益脾养肝方能抑制肝细胞的凋亡作用。

随着研究不断深入，人们发现相关信号通路及转导因子在肝癌的进展过程中发挥巨大作用。miRNA是一种长度为19～24个核苷酸的小分子单链RNA，它们可结合目标靶mRNA的3’非编码区(3’-UTR)从而发挥对于靶标基因的调控作用，进一步参与机体细胞发育以及各种生物学行为过程[9]。目前发现对于HCC，miR-221发挥着在HCC中类似原癌基因的作用[10]，即miR-221是HCC的致癌因子。最近的一项研究表明，miR-221刺激肿瘤的发生并促进肿瘤的进展，从而大大缩短了肝癌小鼠模型的平均死亡时间[11]。miR-221在肿瘤进展中的促进作用可能是由于miR-221参与了某些肝癌癌前病变的机制，如NF-κB途径被认为是炎症和恶性肿瘤之间的潜在联系[12-13]。此外，miR-221还作为肝癌上皮-间质转化过程的启动子，通过靶向AdipoR1基因来激活HCC细胞[14]。而Fu等[15]发现miR-221通过靶向植物同结构域指蛋白(PHF2)促进HCC转移。本研究结果显示建模各组大鼠肝组织miR-221表达水平均明显升高，提示miR-221过表达可能是HCC发生的风险。相对未做任何干预的模型组，护肝片组及益脾养肝方低、中、高剂量组miR-221表达水平均明显降低，提示应用相关药物治疗后，miR-221表达受到抑制。进一步比较发现，护肝片组大鼠miR-221表达水平高于益脾养肝方低、中、高剂量组，而益脾养肝方高剂量组miR-221表达水平均低于低、中剂量组，且益脾养肝方中剂量组miR-221表达水平低于低剂量组。实验结果表明，一定剂量的益脾养肝方对肝组织miR-221表达具有抑制作用。

综上所述，本益脾养肝方能够改善肝脏功能，延缓肝癌癌前病变进展，其治疗机制可能与抑制miR-221表达作用有关。