抽提透刺法对脑梗死模型大鼠脑的保护机制及对CXCL12-CXCR4信号通路的作用研究*

王磊磊，胡方梅，陈 华，孙金鹏，刘国华，崔友祥

河北省沧州中西医结合医院(沧州 061001)

脑梗死(Cerebral infarction，CI) 是中老年人常见的缺血性脑血管病，一般急性起病，并迅速表现为局限性或弥漫性的神经功能缺损症状，是引起人类死亡和残障的重要原因之一[1-3]。神经系统本身具有可塑性，若能采用手段促进脑梗死后神经组织修复和功能重建[4]，对于减轻后遗症状有重要意义。

针刺在脑梗死的治疗中应用已久，尤其在后期康复治疗中，取得了显著疗效[5]。本实验通过观察抽提透刺法对脑梗死模型大鼠神经功能的影响，该疗法能够提高脑梗死大鼠缺血区微血管密度，可上调大脑皮质CXCL12、CXCR4蛋白表达，为抽提透刺法治疗脑梗死提供了理论支持。

材料与方法

1 实验动物 健康雄性SD大鼠56只，清洁级，周龄6～7周，体重260～300 g，平均(282.74±8.74)g，由武汉大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(鄂)2014-0004。所有大鼠每笼5只置于饲养室内进行为期1周的适应性饲养，室温控制在22～25 ℃之间，相对湿度控制在50%～60%，避免噪音、强光刺激，明暗周期为12 h∶12 h，饲以标准饲料和纯净水，大鼠在笼内自由活动及进食饮水，定期清扫鼠笼、更换垫料及消毒。

2 主要药物、试剂与仪器 脑蛋白水解物注射液，规格：每支2 ml，批号：20170723。大脑中动脉栓塞(MCAO) 线栓，购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。VECTASTAIN@ ABC免疫组化试剂盒，购自上海桑戈生物科技有限公司；二氨基联苯胺(DAB)试剂盒，购自上海嵘崴达实业有限公司；大鼠VEGF、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒，购自上海信帆生物科技有限公司；二奎琳甲酸(BCA)法蛋白定量试剂盒，购自北京纽朴生物技术有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒，购自南京巨禄生物科技有限公司；兔血管内皮生长因子(VEGF)多克隆抗体、生物素标记山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)、CXC趋化因子配体12(CXCL12)、CXC趋化因子受体4(CXCR4)、肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG，购自北京冬歌博业生物科技有限公司。

G-L型离心机，德国IKA公司产品；Elisys Duo型全自动酶免分析仪，胡曼诊断产品(北京)有限公司生产；DM4000M型光学显微镜，德国Leica公司产品； Agaro Power型电泳仪，柏业贸易(上海)有限公司产品；Gel Doc EZ型凝胶成像分析系统，美国BIO-RAD公司产品。

3 动物分组及干预方法

3.1 模型建立：经过适应性饲养后，将所有大鼠编号，之后按随机数字表法分为对照组14只及造模组42只。称重后，采用10%水合氯醛35 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于手术台上，颈前部常规进行备皮、消毒，取颈正中2 cm切口，逐层切开并分离筋膜、腺体组织，暴露并分离右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉；造模组采用微动脉夹夹闭右颈总动脉，使颈外动脉游离，用电凝笔电凝颈外动脉分支，于右颈总动脉分叉附近5 mm处将右颈总动脉结扎、离断；暴露颈内动脉，采用微动脉夹夹闭其分支(翼腭动脉)；于颈外动脉残端开口，插入线栓至颈内动脉颅内大脑前动脉，闭塞大脑中动脉开口；剪去尾部多余线栓，除掉微动脉夹，对伤口进行消毒后逐层缝合；对照组手术操作与造模组相同，但只分离血管，不插线栓。术后常规采用青霉素防止感染。术毕1 d，大鼠右侧肢体疼痛回缩反应迟钝、消失，右侧上肢在提尾倒悬时无法前伸，爬行时偏向右侧即为脑梗死模型建立成功；造模过程中出现死亡或者造模失败情况，及时补齐大鼠[5]。

3.2 分组及给药：将造模成功大鼠随机分为模型组、针刺组及药物注射组，各14只。模型建立24 h后，模型组及对照组分别给予生理盐水10 ml/kg，腹腔注射，1次/d；针刺组根据实验大鼠针灸俞穴图谱及针刺手法中的方法，取大鼠的百会透刺双侧曲鬓，使用抽提手法，幅度为0.1～0.2 cm，行针30 s，留针30 min，1次/d；药物注射组给予脑蛋白水解物注射液10 ml/kg，腹腔注射，1次/d。各组大鼠均干预14 d。

4 观察指标及方法

4.1 神经功能评价： 末次给药第2天，参照改良Longa评分评估大鼠的神经功能，评分标准：未见神经功能缺损记为0分；左侧前肢无法伸展完全记为1分；左侧前肢屈曲记为2分；大鼠运动时轻度偏向左侧转圈记为3分；大鼠运动时严重偏向左侧转圈记为4分；大鼠运动时向左侧跌倒记为5分。得分越高，表明大鼠的神经功能缺陷越严重。

4.2 标本采集与处理：完成神经功能评价结束后，采用10%水合氯醛35 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，打开腹腔，自腹主动脉取血5 ml，以3000 r/min速度离心10 min，分离血清，保存于-2 ℃冰箱内备检；横断颈部处死大鼠，打开颅腔，小心取出脑组织，取1/2缺血侧脑组织采用4%多聚甲醛固定，常规经梯度浓度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片，制备厚度为5 μm的组织切片；剩余1/2缺血侧脑组织经液氮速冻，置于-70 ℃冰箱内保存，以用于后续蛋白质免疫印迹(Western blot)检测。

4.3 免疫组化法检测脑组织微血管密度：取脑组织石蜡切片，经二甲苯脱蜡、梯度浓度乙醇复水后，微波炉高火5 min、中10 min行抗原修复，3%过氧化氢30 min阻断内源性过氧化物酶，之后用稀释血清内室温封闭20 min；用VEGF多克隆抗体(1∶200稀释)4 ℃孵育16 h，然后用生物素标记山羊抗兔IgG工作液室温孵育30 min，依次采用免疫组化试剂盒染色30 min，DAB试剂盒显色；经复染、梯度浓度乙醇脱水后，中性树胶封片。在光学显微镜下从热点(棕黄色阳性细胞密集处)内随机选择不重复的5个100倍视野，于400倍镜下计数新生血管数目。新生血管判定标准：每个棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇记为一条微血管，形成管腔者直径需≤8个红细胞直径。微血管密度(MVD)=热点内微血管数目/4。

4.4 ELISA法检测血清VEGF、MMP-9水平：取冻存的血清，迅速融化恢复至室温，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，采用Elisys Duo型全自动酶免分析仪，测定血清VEGF、MMP-9水平。

4.5 Western blot法检测大脑皮质CXCL12、CXCR4蛋白表达水平：取冻存的大脑皮质组织，加入预冷的RIPA制备匀浆，4 ℃下，12000 r/min离心30 min，采用BCA试剂盒确定上清液蛋白浓度；配制好的SDS-PAGE凝胶置于电泳槽内；取蛋白样本30 μg，与上样缓冲液混合，100 ℃变性5 min后加样；电泳至溴酚兰跑至电泳槽底部时停止，将凝胶上目的蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；PVDF膜浸入封闭液室温封闭2 h，然后浸入CXCL12(1∶1000稀释)、CXCR4(1∶1000稀释)一抗工作液及内参β-actin(1∶1000稀释)内，4 ℃摇床孵育16 h；取出、洗涤后浸入二抗工作液(1∶10000稀释)，室温孵育2 h；采用ECL试剂盒化学发光，于暗室内X线胶片曝光、定影。采用Gel Doc EZ型凝胶成像分析系统采集图像，Image pro plus 6.0软件分析各蛋白条带灰度值，计算CXCL12、CXCR4蛋白与内参β-actin灰度值的比值。

5 统计学方法 所有统计数据采用SPSS 22.0统计学软件分析，计量资料以均数±标准差表示,用LSD-t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠神经功能评分比较 见表1。与对照组比较，模型组大鼠神经功能评分明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，针刺组及药物注射组大鼠神经功能评分均较低，且针刺组低于药物注射组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠神经功能评分比较(分)

2 各组大鼠脑组织MVD比较 见表2。免疫组化染色结果显示，VEGF标记的血管内皮细胞胞质被染成棕黄色，在缺血区周围集中分布(图1)。定量分析显示，与对照组比较，模型组大鼠脑组织MVD明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，针刺组及药物注射组大鼠脑组织MVD均较高，且针刺组高于药物注射组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠脑组织MVD比较(个)

A:对照组；B:模型组；C:针刺组；D:药物注射组 图1 各组大鼠脑组织MVD观察(免疫组化染色，×400)

3 各组大鼠血清VEGF、MMP-9水平比较 见表3。免疫组化染色结果显示，与对照组比较，模型组大鼠血清VEGF、MMP-9水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，针刺组及药物注射组大鼠血清VEGF、MMP-9水平均较高，且针刺组高于药物注射组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠血清VEGF、MMP-9水平比较

4 各组大鼠大脑皮质CXCL12、CXCR4蛋白相对表达水平比较 见表4(图2)。免疫组化染色结果显示，与对照组比较，模型组大鼠大脑皮质CXCL12、CXCR4蛋白相对表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，针刺组及药物注射组大鼠大脑皮质CXCL12、CXCR4蛋白相对表达水平均较高，且针刺组高于药物注射组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠大脑皮质CXCL12、CXCR4 蛋白相对表达水平比较

图2 Western blot法检测各组大鼠大脑皮质 CXCL12、CXCR4蛋白相对表达结果

讨 论

近年来，由于生活水平提高、饮食习惯改变，社会步入人口老龄化等原因，脑梗死的发病率呈现不断上升趋势，已经成为重要的社会公共健康问题。脑梗死是由多种因素引起的一种十分复杂的级联损伤反应，发病初期由于血管阻塞，缺血区神经细胞绝大部分功能丧失而并未全部坏死，随着缺血时间延长，缺血中心部分神经细胞进一步坏死形成不可逆的梗死灶；而梗死灶周围缺血半暗带区仍有少量血供残留，该区内神经细胞多受到可逆性损伤，若能尽早建立侧支循环，恢复血供，对于挽救缺血半暗带、促进神经细胞损伤修复及改善预后有重要意义[6-8]。中医认为，该病属于“中风”范畴，针刺治疗的历史悠久且疗效确切。针刺的种类繁多，其中以头穴针刺最为常见。田亮等[9]总结认为，头穴针刺治疗中风的机制包括：扩张血管，改善脑组织血液循环以及能量代谢；调节神经生长因子表达水平，加速神经干细胞增殖、分化，提高神经功能；抑制兴奋性氨基酸水平和毒性，减少神经损伤；抑制炎性免疫反应；改善脂质代谢，清除氧自由基；抑制神经细胞凋亡等等。但是上述机制也并不完全，仍需进一步研究探讨。

在本次研究中，我们采用线栓法建立的脑梗死模型大鼠，结果发现，模型组大鼠神经功能评分明显高于对照组，提示成功建立脑梗死模型；之后采用抽提透刺法对模型大鼠进行治疗，取穴为百会透双侧曲鬓，于学平等[10]研究认为，百会透刺曲鬓穴对于脑微血管纤维连接蛋白的表达有促进作用，减轻脑缺血再灌注相关的组织损伤。本次治疗后，针刺组及药物注射组大鼠神经功能评分低于模型组，且针刺组小于药物注射组，表明抽提透刺法确实有效改善了脑梗死模型大鼠的神经功能，发挥脑保护作用。

微血管生成对于缺血区脑组织侧支循环建立具有重要意义，有助于减轻梗死区周边神经细胞损伤，控制病情进展，也有利于神经细胞修复[11-12]。本次研究发现针刺组及药物注射组大鼠脑组织MVD均高于模型组，且针刺组高于药物注射组，提示抽提透刺法能有效增加脑梗死模型大鼠脑组织微血管密度，促进侧支循环建立，与相关报道一致[13-14]。而关于其具体的作用机制，可以从CXCL12-CXCR4信号通路及其相关因子方面进行探讨[15-17]。CXCL12属于CXC趋化因子超家族成员，CXCR4则为受体，二者在多种细胞和组织中表达，结合后可通过耦联的G蛋白等转化为生物信号，参与细胞增殖、分化、血管及神经生成等多种过程[18-20]。有研究认为，CXCL12-CXCR4在血管修复和再生过程中起到重要的促进作用[21]。CXCL12对于MMP-9的表达有上调作用，而MMP-9可以加速细胞外基质降解和重组，促进血管生成；此外，CXCL12- CXCR4具有血管刺激作用，能够促进VEGF表达，VEGF是已知最强的特异性促血管生成因子，其能促进血管内皮细胞增殖，启动脑梗死后血管新生。又有研究称，补充VEGF有助于脑梗死大鼠梗死区周边血管新生和神经功能恢复[22]。本次研究结果显示，与模型组比较，针刺组及药物注射组大鼠血清VEGF、MMP-9水平较高，大脑皮质CXCL12、CXCR4蛋白表达水平较高，且针刺组高于药物注射组，表明抽提透刺法能促进脑梗死模型大鼠脑组织CXCL12-CXCR4信号通路激活，上调血管生成相关因子VEGF、MMP-9水平，这可能是抽提透刺法促进微血管形成，加速神经损伤修复，保护脑组织的作用机制之一[23]。

综上所述，抽提透刺法能有效改善脑梗死大鼠神经功能，提高缺血区微血管密度，其脑保护作用可能与上调CXCL12-CXCR4信号通路相关蛋白表达有关。