手十二井穴刺络放血对急性创伤性脑损伤小鼠神经功能及坏死性凋亡相关蛋白表达的影响研究*

李 博，李宛蓉

1.天津中医药大学(天津 300193)；2.同济大学(上海 200092)

世界卫生组织将急性创伤性脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)定义为外部物理力量对头部的机械能量所造成的伤害。在全球范围内，TBI是造成残疾和伤害相关死亡的主要原因[1-4]。据统计，每年都有超过5000万的新发TBI患者，中国的TBI患者数量超过了绝大多数国家且逐年递增[5-6]。颅脑创伤是一系列复杂的病理过程，在TBI的几分钟到数日之内，受损区域周围的健康组织经历相互交叉影响病理改变，包括炎症反应、免疫应激、微循环障碍、凝血障碍、血脑屏障功能破坏以及血管活性物质失位等[7-10]。

根据Lancet最新公布的TBI临床管理指南，TBI的临床管理目前主要包括维持患者生命体征、颅内出血控制和紧急手术治疗[11]。然而上述这些治疗方法也存在一定风险，并且可能与更不良的临床结果相关，该指南也表示“优先考虑更保守的医学方法是更合理的”。多项临床研究证实，手十二井穴刺络放血对于TBI患者昏迷促醒以及伤后的功能恢复具有积极作用[12-13]，早期应用手十二井穴刺络放血疗法可显著降低TBI和脑缺血后的水肿状态，具有确切的脑保护作用[14-16]。然而目前关于手十二井穴刺络放血抑制颅脑创伤炎症反应的机制研究较少。坏死性凋亡是近期发现的一种新的炎症诱导通路，参与颅脑创伤的多个进程，是颅脑创伤后一系列继发性损伤的重要靶点。故本研究以 TBI 模型小鼠作为研究对象，采用手十二井穴刺络放血干预，通过病理损伤评估和坏死性凋亡相关蛋白检测，探讨该干预方法对TBI后的炎症反应以及神经功能损害的影响。

材料与方法

1 动物与分组 实验动物选用C57BL/6雄性小鼠，10～12周龄，体重(20±5) g，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK-[京]2019-0005，饲养于武警特色医学中心脑创伤与神经疾病研究所，正式实验前将小鼠适应性喂养1周，自然照明，环境温度控制在(26±1)℃，相对湿度(55±5) %，自由饮水进食，保持通风及清洁卫生。实验遵循《实验动物护理和使用指南》。

2 主要试剂与仪器 液压冲击脑损伤仪(Custom Design & Fabrication，美国)，小鼠脑立体定位仪(深圳瑞沃德，中国)，倒置荧光显微镜(Thermo Fisher Scientific，美国)，全波长酶标仪(Thermo Fisher Scientific，美国)，Ultrafreeze 3410超低温冰箱(日本三洋电机株式会社)，低温高速离心机(Thermo Fisher Scientific，美国)，Anti-RIP-1/Anti-RIP-3/Anti-MLKL(Abcam，美国)，TNF-α/IL-6/IL-1β ELISA试剂盒(Bio-world，美国)。

3 实验流程 将小鼠编号后，依照随机数字表法随机分为假手术组、模型组、井穴放血组，每组20只。井穴放血组仅在造模完成后即刻进行1次放血，每次放血10 μl；模型组仅清洁消毒创口，不做任何治疗；假手术组仅开骨窗，不进行eCCI撞击。

4 模型制备与鉴定 采用电子控制性脑皮质撞击法制备重型皮质下颅脑创伤小鼠模型(eCCI模型)[17]。将小鼠开颅窗后固定于eCCI撞击内支架固定平台，设置eCCI撞击参数：撞击速度(Velocity)=5 m/s，撞击深度(Deeph)=1.5 mm，撞击最低点持续时间(Time)=120 ms，使用直径3 mm撞击锤，撞击臂与垂直方向成15°角，手术后观察小鼠呼吸情况并清洗创口血液，待小鼠生命体征平稳后缝合头皮。

5 实验方法 手十二井穴定位参照《实验针灸学》中的动物腧穴定位[18]，并参考比较解剖学方法以及人体相应穴位解剖标志，选取小鼠前肢各趾相应部位选取相应位置，井穴放血工具选用1 ml注射器针头，于双侧前肢趾端的十二井穴点刺放血，进针角度与水平面45°夹角，放血出血量为每个穴位5～8 μl。

6 观察指标及检测方法

6.1 改良神经功能缺损评分：分别采用改良神经功能缺损评分(Modified Neurological Severity Scores，mNSS)对颅脑创伤后12、24、48、72 h的实验小鼠的神经功能进行评价，评分项目由运动功能、平衡功能、感觉功能、反射功能及异常体征(癫痫、肌痉挛、肌张力障碍)组成评分系统[19]。得分越高则表示神经功能缺损情况越严重，总得分最低为 0分，提示小鼠完全正常，没有神经功能缺陷，最高为18分，提示小鼠意识丧失或死亡。

6.2 脑组织病理：eCCI造模后72 h，各组随机选取5只小鼠，使用5%水合氯醛(0.07 ml/10 g)麻醉处死并快速断头取脑，将完整脑组织放入多聚甲醛溶液中固定1周。固定完成后进行石蜡包埋，设置震荡切片机切片厚度为25 μm，对小鼠脑组织损伤区域进行连续切片，间隔1 mm 切片10张。将脑组织切片平摊在玻璃载玻片上，放至55 ℃干燥箱中烘烤5 h直至脱蜡，取出冷却至室温后进行水化与染色，脱水封片后于光镜下观察。

6.3 RIP-1、RIP-3、MLKL蛋白相对表达量：使用Western blot法检测蛋白表达量。治疗结束后，断头取脑，冰上快速钳取脑组织损伤区域，用电子天平称取约50 mg，提取脑组织蛋白并定量；依照待测蛋白分子量的大小，需要使用不同浓度的SDS-PAGE分离胶，蛋白变性后进行电泳及转膜，转膜结束后将抗体残余洗净，使用化学发光成像系统拍摄，Image J软件对条带图像进行灰度值分析，目的蛋白/内参蛋白灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。

7 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，数据采用均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 手十二井穴刺络放血对神经功能的影响 见表1。各组小鼠创伤前 mNSS 评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性；各组小鼠在创伤后12 h进行 mNSS 评分，模型组与干预组小鼠 mNSS 评分均大于8分，说明模型建立成功，并且井穴放血组的mNSS 评分显著低于模型组；与假手术组相比，模型组的mNSS评分在创伤后12、24、48、72 h均显著升高(P<0.01)，虽然随着时间的延长，mNSS 评分呈下降趋势，但在72 h内均大于8分，表示在损伤后的72 h内小鼠一直处于重型颅脑创伤的状态，神经功能未能有效恢复；井穴放血组的mNSS 评分在创伤后12、24、48、72 h均显著低于模型组(P<0.01)，并且在创伤后48 h，井穴放血组小鼠的mNSS已降低至9分以下，表示在损伤48 h后颅脑创伤的损伤评级已下降至中度颅脑创伤，神经功能有较大程度的恢复。

表1 各组小鼠创伤前后神经功能缺陷评分比较(分)

2 手十二井穴刺络放血对脑组织病理学的影响 镜下观察各组小鼠脑组织HE染色结果，可见假手术组小鼠脑组织皮层及海马区结构完整，神经元与胶质细胞层形态规则，细胞膜染色均一；模型组小鼠受撞击处脑组织结构缺如，脑组织缺损边缘有红色透明滴状物与胶质细胞增生，海马区神经元细胞形态松散且数量明显减少，皮层下近海马区位置有明显的局灶性出血并伴有散在的炎性细胞浸润；井穴放血组小鼠脑组织皮层可见明显缺如，但与模型组对比，缺如面积明显减小，海马区神经元细胞核膜固缩及空泡程度减轻且完整形态的细胞数量较多，皮层下近海马区未见明显红细胞渗出(图1)。

3 手十二井穴刺络放血对TBI后小鼠坏死性凋亡相关蛋白相对表达量的影响 见表2(图2)。对坏死性凋亡通路关键蛋白进行检测，结果发现，与假手术组相比，模型组RIP-1蛋白表达在颅脑创伤后6、48、72 h均显著升高(P<0.01)，在颅脑创伤后48 h差异无统计学意义(P>0.05)，与模型组相比，井穴放血组RIP-1蛋白表达在颅脑创伤后6、24、48、72 h均显著降低(P<0.01)。与假手术组相比，模型组RIP-3蛋白表达在颅脑创伤后6、24、48、72 h均显著升高(P<0.01)，与模型组相比，井穴放血组RIP 3蛋白表达在颅脑创伤后6、24、48、72 h均显著降低(P<0.01)。与假手术组相比，模型组MLKL蛋白表达在颅脑创伤后24、48、72 h均显著升高(P<0.01)，在颅脑创伤后6 h差异无统计学意义(P>0.05)，与模型组相比，井穴放血组MLKL蛋白表达在颅脑创伤后6、24、48、72 h均显著降低(P<0.01)。

表2 各组小鼠TBI后RIP-1、RIP-3、MLKL 蛋白相对表达量

图2 各组小鼠TBI后RIP-1、RIP-3、MLKL蛋白相对表达量

讨 论

对于颅脑创伤的病因病机，古代医家大多从“血瘀”论述。关于颅脑创伤的病因病机最早可见于《灵枢·贼风》，其中记载：“若有所坠堕，恶血留内而不去”。随着中医学的发展，医家普遍认同“血瘀”是颅脑创伤最重要的病机，明代陈实功所著《外科正宗·卷之四》曾记载“如从高坠堕而未经损破皮肉者,必有瘀血流注脏腑，人必昏沉不省”。

手十二井穴刺络放血活血化瘀的作用源于经典，在《黄帝内经》中已得到充分的体现与重视。在《灵枢·九针十二原》中开宗明义的提出了针灸的治法原则“凡用针者，虚则实之，满则泄之，菀陈则除之”，《素问·针解》中可见“菀陈则除之者，去恶血也”的记载，在《素问·调经论》也提到：“病在血，调之络，视其血络，刺出其血，无令恶血得入于经，以成其疾”的观点，在《素问·阴阳应象大论》中明确指出“血实宜决之”的观点，张景岳注云“决为泄去其血也”，可见所谓“决之”的方法独指刺络放血，而非其他针刺方法，而在《素问·缪刺论》中更是详细描述了刺络放血的方法和部位“视其病，缪刺之于手足爪甲上，视其脉，出其血，间日一刺，一刺不已，五刺已。”

手十二井穴刺络放血活血化瘀的作用与手十二井穴的物质结构基础有关。从解剖结构的角度看，手十二井穴的位置分布于手指末端的桡侧缘或尺侧缘，该位置分布有茂密的毛细血管动、静脉网和丰富的末梢神经网络以及血管壁上的植物神经，尤其是感觉传入神经纤维的分布更是躯干部位的数倍之多[20]，这也就决定了同样强度的刺激，在手十二井穴处接受到的感觉刺激也会呈现数倍之强；从微观的生物力学和分子生物学的角度看，手十二井穴刺络放血可能通过影响血流剪切力并通过井穴的特殊结构将该刺激放大从而作用于血管内皮，血管内皮细胞表面分布有丰富的交感神经与神经递质类分子，例如前列腺素、一氧化氮等，这些物质既具有刺激循环系统的作用,又能发挥其对局部血管壁上的植物神经的刺激效应，从整体和局部方面调节血压、血管壁张力和体液渗透压等作用，继而产生活血化瘀作用[21]。

坏死性凋亡是近期发现的一种新的细胞死亡形式，它是一种受调节的坏死形式，濒死的细胞破裂并释放细胞内的成分，可以触发先天免疫反应，参与多种疾病的炎症反应过程，例如颅脑损伤、冠状动脉粥样硬化、细菌感染、肠炎、胰腺炎等。受体相互作用蛋白 3(Receptor-interacting protein3，RIP3)是诱导坏死性凋亡的关键启动子，对激活/抑制坏死性凋亡通路具有重要影响。有研究表明RIP1的相似结构域分子RIP3也参与了坏死性凋亡通路的启动，并可诱导混合连接激酶结构域样蛋白(Mixed lineage kinase domain-likeprotein，MLKL)基因表观发生改变，最终促使细胞凋亡并释放炎症因子[22-24]。本研究中的结果显示，TBI后的6～72 h，模型组的RIP-1、RIP-3、MLKL蛋白明显升高，而井穴放血组则明显逆转了这一趋势，这可能与刺激井穴从而激活了大脑中某些特定的功能核团分泌具有免疫功能的神经递质有关，一项研究通过刺激位于正中神经的内关穴来激活中脑导水管分泌增食欲素，另有一项研究通过刺激位于腕屈肌腱尺神经分布部位的神门穴激活下丘脑弓状核的内啡肽受体[25-26]，而神门穴和内关穴的解剖结构与井穴存在高度的相似特性，均分布有大量神经和血管，由此可见手十二井穴刺络放血抑制坏死性凋亡相关蛋白表达的功能，与神经-血管-免疫相互作用关系密切。

手十二井穴刺络放血在临床中用于治疗TBI效果显著，本研究基于坏死性凋亡通路观察手十二井穴刺络放血对TBI小鼠的治疗作用，发现手十二井穴刺络放血可通过抑制RIP-1、RIP-3、MLKL蛋白表达，缓解炎症反应，发挥神经保护作用，改善神经功能缺损等相关症状，为临床治疗TBI提供了实验依据。