丹参酮ⅡA磺酸钠对高脂血症勃起功能障碍大鼠Nrf2/HO-1通路及勃起功能的影响*

丁 维，钟立仁，张海波，范钧泓，王 力，何书华，王明强，韦安阳△

1.贵州中医药大学附属第一医院泌尿外科(贵阳 550001)；2.南方医科大学南方医院泌尿外科(广州 510515)；3.贵州中医药大学(贵阳 550025)

勃起功能障碍(Erectile dysfunction,ED)是指无法获得或(和)保持足够的勃起功能进行满意的性交[1-2]。中医又称作阳痿，《黄帝内经》对阳痿的论述较多，归因于气虚过甚，素有“气大衰而不起不用”；又有“伤于寒则阴缩入，伤于热则纵挺不收”；亦可由于房劳。有研究显示ED的患病率随着高脂血症的严重程度呈线性增加[3]。高脂血症(Hyperlipidemia,HR)状态下，血液中的脂质水平升高并被过氧化，此过程有助于产生活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)。ROS生成增多会使机体氧化应激水平增加，从而导致一系列对组织有害的连锁反应，此病理过程与高脂血症性ED关系密切[4]。

丹参为唇形科鼠尾草本属植物，药用其根。丹参味苦，药性微寒，入心肝二经[5]。《本草正义》云“丹参专入血分，其功在于活血行血，内之达脏腑而化瘀滞，故积聚消而癥瘕破;外之利关节而通脉络，则腰膝健而痹着行”，阐明了丹参具有凉血消肿，活血化瘀的功效。据《景岳全书》记录，丹参“亦能养阴定志，益气解烦”，而《滇南本草》谓丹参“补心定志，安神宁心”。现代药理学表明其化学成分主要由水溶性酚酸类及脂溶性丹参酮类化合物组成[6]。丹参酮ⅡA磺酸钠(Sodium tanshinone ⅡA sulfonate,STS)是丹参酮ⅡA的水溶性衍生物，而丹参酮ⅡA是从丹参根部分离得到的脂溶性二萜类化合物。STS是一种传统的中草药，可有效治疗各种心血管疾病，如缺血性中风和心肌梗死等[7]。有研究发现STS可通过提高核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor,Nrf2)和血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)的表达水平进而增加机体的抗氧化能力[8]。前期研究发现高脂血症ED大鼠体内氧化应激水平上升，本实验将进一步观察STS对Hrf2/HO-1通路及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)表达的影响，探讨其对改善高脂血症ED大鼠勃起功能的机制。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物：8周龄250～300 g的Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠18只，所有大鼠均在南方医院实验动物中心饲养，12 h/12 h自然昼夜光线照射，标准温度(22～25) ℃、湿度(60±10)%。所有雄性大鼠在实验前均通过交配试验以证明勃起功能正常。

1.2 主要实验器材与试剂：Biopac Systems海绵体内压特定仪(操作软件：Biopac System AcqKnowledge 4.4)；氧化应激指标SOD、GSH和MDA购于南京建成生物工程研究所；山羊抗鼠、兔二抗(Proteintech)； Nrf2一抗(Abcam)；HO-1一抗(Proteintech)； Western blot二抗(Abbkine)。

2 实验方法

2.1 实验动物分组：所有大鼠适应性喂养2周后随机分为三组，分别为正常组、高脂血症组、高脂血症加丹参酮ⅡA磺酸钠组各6只。高脂血症加丹参酮ⅡA磺酸钠组为造模成功后的高脂血症大鼠每天腹腔注射10 mg/kg的STS溶液；而高脂血症组则予以腹腔注射等量生理盐水，以上治疗处理持续16周。

2.2 HR大鼠模型的建立：为了建立高脂血症模型，本研究使用高脂饲料喂养大鼠。分配为高脂血症组及高脂血症加丹参酮ⅡA磺酸钠组的大鼠均喂养高脂饲料，喂养时间持续16周。按Bakircioglu造模方法,高脂饲料的主要成分为胆固醇(2%)、猪油(10%)、蛋黄粉(10%)、正常鼠粮(79%)。与此同时，对照组大鼠同时接受正常饲料喂养。

2.3 大鼠阴茎海绵体压力测定及颈动脉测压：HR大鼠模型建模成功后及注射STS或生理盐水16周后，对各组大鼠进行阴茎勃起功能检测和颈动脉压力测定。对实验用大鼠称重和麻醉成功后，打开盆腔并定位海绵体神经。使用正负电极刺激神经促使阴茎勃起，刺激参数设置为：振幅(5 mA)，频率(50 Hz)，脉冲宽度(61.66 ms)，持续时间(50 s)。选取靠近龟头的阴茎两侧部分作为穿刺点，穿刺针连接的压力感受仪可对阴茎海绵体内的压力进行检测。打开刺激电极刺激50 s，收集刺激期间的数据并重复上述步骤3次，记录并保存ICP压力曲线文件。ICP压力测定后，通过穿刺颈动脉对压力进行测定，记录并保存颈动脉压力(Mean arterial pressure,MAP)曲线文件，以进行后续分析。

2.4 组织取材：大鼠阴茎海绵体内压力和颈动脉内压测量结束后，弯镊子夹住阴茎的龟头后使用眼科剪在根部处剪断阴茎。丢弃阴茎的龟头端，并沿着远端到近端的方向用镊子挤出阴茎中剩余的血液，使用生理盐水进行漂洗，直至冲洗液无色透明为止。将阴茎浸入生理盐水中，用弯镊将尿道海绵体部分及表面的筋膜撕下并丢弃，使用预冷的PBS彻底清洁剩余的海绵体。最后加入液氮中保存，用于后续的Western blot和其他检测。

2.5 Western blot检测蛋白表达：采用Western blot法检测大鼠阴茎海绵体平滑肌中Nrf2、HO-1的蛋白表达。

2.6 血清及组织氧化应激标记物和血脂水平测定：将阴茎组织加入Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)中匀浆，在4 ℃下14000 r/min离心10 min，收集上清液进行生化分析。根据制造商的说明使用检测试剂盒对阴茎组织中的丙二醛、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的水平进行测定。用试剂盒检测大鼠血清总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的水平。

结 果

1 各组大鼠体重及血脂变化 见表1、2。造模前，各组大鼠体重比较，差异无统计学意义(P>0.05)；造模后，高脂血症组和丹参酮ⅡA磺酸钠组的体重比正常组有明显的增高，差异有统计学意义(P<0.05)；造模前，各组大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C比较，差异无统计学意义(P>0.05)；高脂血症大鼠给予STS治疗16周后TG较正常组明显降低，HDL较正常组明显升高，且差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠造模前后体重比较(g)

表2 各组大鼠造模前后血脂水平比较(mmol/L)

2 各组大鼠勃起功能比较 见表3。通过对ICP/MAP结果进行分析，高脂血症组勃起功能明显降低，平均ICP和ICP/MAP比值较正常组明显降低(P<0.05)。与高脂血症组大鼠相比，丹参酮ⅡA磺酸钠组大鼠勃起功能显著改善，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠勃起功能比较

3 各组大鼠阴茎海绵体组织的氧化应激水平比较 见表4。高脂饮食诱导的高脂血症大鼠阴茎海绵体组织内，SOD及GSH含量降低而MDA含量增高，与正常组大鼠相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。与高脂血症组比较，STS治疗能提高高脂血症大鼠海绵体组织内SOD，GSH水平，而MDA的水平显著降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠阴茎海绵体平滑肌SOD、GSH、MDA比较

4 各组大鼠阴茎海绵体组织Nrf2和HO-1相对表达水平比较 见表5(图1)。Western blot检测阴茎海绵体组织内Nrf2和HO-1的表达水平可发现，高脂血症组大鼠的海绵体组织的Nrf2和HO-1表达水平较正常组上升，但两组差异无统计学意义(P>0.05)。丹参酮ⅡA磺酸钠组大鼠的阴茎海绵体组织的Nrf2和HO-1表达水平较高脂血症组进一步提高，且差异有统计学意义(P<0.05)。

表5 各组大鼠阴茎海绵体平滑肌Nrf2、HO-1 蛋白相对表达比较

图1 各组大鼠阴茎海绵体平滑肌Nrf2、HO-1蛋白相对表达

讨 论

大量的研究表明，氧化应激在高脂血症ED的发病过程中起着重要作用[9]。阳痿的发病与肾、肝、心、脾功能失调有关，尤其与肝的疏泄条达，情志异常密切相关。情志不遂可致肝气郁滞，进而导致阳痿，《素问·痿论》曰：“思想无穷，所愿不得……宗筋弛纵,发为筋痿”；《顾松园医镜》亦有记载：“阳痿有因志意不遂所致者”；清代医家沈金鳌认为有志难舒，则肝气难以条达舒畅，可能导致阳器不用。而现代研究认为情志不畅与氧化应激关系密切，情志异常，烦躁易怒会使体内氧化应激损伤加重，而氧化应激所产生的超氧化物会进一步导致情志异常。本研究发现，HR组大鼠出现勃起功能障碍，而经STS治疗后高脂血症大鼠勃起功能得到明显改善，具体的机制可能与STS介导的抗氧化应激有关。Nrf2是体内调节氧化还原平衡的关键信号因子，它能调节一系列保护机体免受氧化应激损伤的基因表达，包括GSH，SOD和HO-1[10]。HO-1是Nrf2下游的效应因子，被认为是细胞内最重要的抗氧化物质之一。Nrf2/HO-1抗氧化通路的激活有助于保护组织免受多种疾病的侵袭[11]。本研究发现，高脂血症状态下大鼠阴茎海绵体组织中Nrf2和HO-1的蛋白水平表达上升，表明当机体氧化应激水平上升时，Nrf2和HO-1会反射性激活以保护机体。此外，研究结果发现高脂血症大鼠阴茎海绵体MDA含量增加，SOD和GSH水平下降，表明阴茎海绵体组织内发生了氧化应激的损伤，阴茎海绵体平滑肌功能受损。本研究结果也在高脂饲料喂养大鼠模型的其他研究中可观察到，佐证了本研究的结果[12]。

丹参酮ⅡA磺酸钠是中药丹参中分离的丹参酮ⅡA经磺化得出的水溶性物质。研究表明，STS具有清除自由基与抗氧化应激、抗炎抑菌、改善血液循环等作用[13]。本次研究发现STS能显著增加高脂血症大鼠海绵体组织中Nrf2和HO-1的表达，提示STS增强了高脂血症大鼠的抗氧化能力，表明激活Nrf2/HO-1通路在保护组织免受氧化应激方面发挥关键作用[14]。本研究同时发现，STS治疗可显著提高GSH、SOD的水平和降低MDA含量，表明STS治疗能有效降低阴茎海绵体内氧化应激水平，由于ROS导致一系列损伤会导致ED，因此可推断STS可通过抑制高脂血症的氧化应激而发挥治疗作用。另外，氧化应激的增加可以通过低密度脂蛋白的氧化来促进动脉粥样硬化疾病，而氧化低密度脂蛋白本身可以通过诱导未耦合的eNOS、线粒体电子传递链、黄嘌呤氧化酶和NAD(P)H氧化酶来增加超氧阴离子生成，导致了ROS的进一步生成。本次研究发现，HR组大鼠LDL较NC组显著增高，而氧化LDL增加了体内氧化应激的发生，而STS组较HR组TG明显降低，HDL明显升高，Silva等[15]的实验研究表明丹参酮ⅡA能降低血清甘油三酯(TG)的水平，增加家兔血清一氧化氮浓度，从而达到抗动脉粥样硬化的效果，STS能降低大鼠体内TG水平，可能是在延缓阴茎小动脉粥样硬化的发生方面起到了保护作用。因此，STS可通过激活Nrf2/HO-1通路增加抗氧化能力，进而降低TG浓度，提高HDL含量，改善高脂血症大鼠的勃起功能。本研究为探索STS在治疗高脂血症导致的ED提供了理论依据。