不同澄清工艺对柠檬果汁品质影响及柠檬苦素贮存期间降解速率预测模型建立

蒋永波,汪开拓,*,代领军,邱玲岚,张帮奎,黎春红,雷长毅,龚 月,皮裕琳(.重庆三峡学院生物与食品工程学院,重庆 40400;.重庆汇达生物科技股份有限公司,重庆 40660)

柠檬(Citruslimon(L.)Burm.F.)为芸香科柑橘属常绿小乔木植物,成熟的柠檬果实色泽鲜艳、风味浓郁、质地饱满、果汁酸涩且出汁率高,同时富含各种水溶性维生素、矿物质、植物蛋白和不饱和脂肪酸等微量元素以及酚酸、类黄酮和苦素等功能性物质,展现出优质的食品加工特性和较高的营养价值[1]。但由于柠檬果实酸涩的味觉特征,鲜果除少部分作为鲜食外,很大部分柠檬果实需进行深加工处理[2]。非浓缩还原果汁(Not From Concentrate,NFC)是鲜榨果汁经过巴氏消毒直接灌装而成,既能保持果实原有风味,又可将果实中各种功能性成分和营养物质最大限度保留下来,可作为鲜食产品或食品加工原料,因此在柠檬果实深加工中具有较大的应用潜力[3]。

传统NFC橙汁加工过程中,果汁鲜榨后存在“后苦”和混浊现象,因此需进行脱苦和澄清处理以使橙汁中苦味物质(如柚皮苷和类柠檬苦素)含量降低并增加透光度,从而在味觉和视觉上满足消费者要求[4]。从保健角度而言,柠檬苦素是一种氧化性四环三萜类(Triterpenoids)有机物,动物实验证实该化合物具有有效降低血脂、促进肠道菌落平衡、提高神经兴奋性、预防肿瘤和改善免疫力等功能,故富集和开发价值极高[5]。前期在开发柠檬NFC果汁的过程中发现,柠檬原果汁口感极为酸涩,不适宜直接饮用,但可作为冲调饮料、调味替代品或食品加工原料,故果汁开发过程中,可适量保留柠檬苦素,以增加产品的功能性。

因此,本研究主要分析较适合工业生产的四种澄清工艺(琼脂絮凝法、酶解-吸附联用法、酶解-絮凝联用法和冻融细胞破碎法)对柠檬鲜榨果汁的澄清效果,并构建在不同温度贮存下柠檬清汁中柠檬苦素降解的预测模型,从而为柠檬NFC果汁的开发和类苦素的自然降解提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柠檬(品种为“尤力克”)NFC原果汁 由重庆市潼南区汇达柠檬科技集团有限公司饮料加工厂提供,鲜榨果汁透光度为47.7%;柠檬苦素标准品(≥95%) Sigma公司;酸性纤维素酶(10000 U/mL)、果胶酶(10000 U/mL) 食品级,山东隆科特酶制剂有限公司;琼脂 食品级,浙江百宏食化有限公司;酸性壳聚糖 食品级,南京熙美诺生物科技有限公司;活性白土 济南清海化工有限公司;柠檬酸、无水乙醇、硫酸铵、三氯化铁 分析纯,成都市科龙试剂厂;对二甲氨基苯甲醛 分析纯,天津市大茂化学试剂厂;浓硫酸、三氯乙酸 分析纯,重庆川东化工集团有限公司;咔唑 分析纯,百灵威科技有限公司。

DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;TDL-5-A型离心机 上海安亭科学仪器厂;752型紫外可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;Agilent 1100型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司;LHS-250HC-I型恒温恒湿箱 上海一恒科学仪器有限公司;超滤机 重庆佳和过滤技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 琼脂絮凝法:初榨柠檬果汁→适量溶解的琼脂粉→絮凝→200目尼龙网粗滤→5000 r/min离心5 min(20 ℃)

酶解-吸附联用法:初榨柠檬果汁→一定量的果胶酶+一定量的纤维素酶(40 ℃)酶解一定时间→一定量的活性白土吸附→5000 r/min离心5 min(20 ℃)

酶解-絮凝联用法:初榨柠檬果汁→加入一定量的果胶酶(40 ℃)酶解一定时间→壳聚糖絮凝→5000 r/min离心5 min(20 ℃)

冻融细胞破碎法:初榨柠檬果汁→一定温度下冷冻24 h→一定温度下解冻4 h→200目尼龙网粗滤→5000 r/min离心5 min(20 ℃)

离心后的柠檬果汁经中空纤维膜进行超滤(外径<300 μm,内径>100 μm)后得到柠檬清汁,再经巴氏灭菌法(68 ℃,30 min)进行灭菌处理,随后保温30 min再进行瓶灌(20 mL PET瓶)。

1.2.2 澄清工艺参数的优化 通过预实验得出以下实验因素水平,琼脂絮凝法选取琼脂粉用量和絮凝时间为主要因素,设计2因素3水平交互试验(表1);酶解-吸附联用法选取果胶酶用量、纤维素酶用量、酶解时间和活性白土用量为主要因素,设计4因素3水平正交试验(表2);酶解-絮凝联用法选取果胶酶用量、酶解时间、壳聚糖用量和絮凝时间为主要因素,设计4因素3水平正交试验(表3);冻融细胞破碎法选取速冻温度和解冻温度为主要因素,设计2因素3水平交互试验(表4)，以上实验均以澄清度为指标。

表1 柠檬NFC果汁琼脂絮凝澄清工艺交互试验设计表Table 1 Design of interaction trials in clarification process of lemon NFC juice by agar flocculation

表2 柠檬NFC果汁酶解-吸附联用澄清工艺正交试验因素水平设计表Table 2 Design of factors and levels in orthogonal trials of clarification process of lemon NFC juice by combination of enzymolysis and adsorption

表3 柠檬NFC果汁酶解-絮凝联用澄清工艺正交试验因素水平表Table 3 Design of factors and levels in orthogonal trials of clarification process of lemon NFC juice by combination of enzymolysis and flocculation

表4 柠檬NFC果汁冻融细胞破碎澄清工艺交互试验设计表Table 4 Design of interaction trials in clarification process of lemon NFC juice by freezing and thawing

1.2.3 柠檬清汁产品的贮藏 按1.2.1所述,经四种工艺澄清得到的柠檬清汁产品(20 mL分装)分别置于设定为278.15 K(5 ℃)、283.15 K(10 ℃)、288.15 K(15 ℃)、293.15 K(20 ℃)、298.15 K(25 ℃)和303.15 K(30 ℃)6个梯度温度的培养箱中贮存(70%～80%,R.H.)。其中,果汁在278.15 K(5 ℃)或283.15 K(10 ℃)温度下贮存48 d,期间每隔6 d虹吸取样;在288.15 K(15 ℃)或293.15 K(20 ℃)温度下贮存32 d,期间每隔4 d虹吸取样;在298.15 K(25 ℃)或303.15 K(30 ℃)温度下贮存16 d,期间每隔2 d虹吸取样,所有样品均用于柠檬苦素含量的测定。

1.2.4 柠檬苦素含量降解预测模型 根据柠檬清汁中柠檬苦素含量在贮存期间含量变化的数据,通过苦素含量与贮存时间的多级方程拟合,得出各贮存温度下柠檬清汁中柠檬苦素含量与贮存时间均满足一级反应模型,预测模型可表示为方程(1):

式(1)

其中,Ct-某一温度下某一时间下柠檬清汁中柠檬苦素含量,mg/mL;C0-柠檬清汁中柠檬苦素贮存前含量(t=0),mg/mL;k-降解速率常数,d-1;t-贮存时间,d。

进一步,方程(1)中各贮存温度下柠檬苦素降解速率常数k值满足Arrhenius方程,即:

式(2)

其中,A-Arrhenius因子或指前因子,min·d-1;R-通用气体常数,8.314 J/(mol·K);T-绝对温度,K;Ea-活化能,J/(mol·K)。

联立方程(1)和方程(2),可得:

式(3)

方程(3)即为有关柠檬清汁贮存期间柠檬苦素含量降解的一级动力学模型。左式是柠檬苦素含量相关函数,右式与贮存时间和温度有关。前期澄清工艺对函数的具体内容有影响,需通过试验进行分析。柠檬苦素为柠檬清汁产品的重要功能性指标,其变化规律可利用Arrhenius方程进行预测。

1.2.5 测定指标

1.2.5.1 澄清度测定 柠檬果汁澄清度参考金丽梅等[6]方法进行测定,以果汁在625 nm 处透光度来表示。

1.2.5.2 品质测定 柠檬果汁中可溶性固形物(TSS)和可滴定酸(TA)的测定分别采用手持折光仪法和酸碱滴定法进行测定[7]。

1.2.5.3 果胶含量测定 柠檬果汁中总果胶含量的测定参考Simpson等[8]方法进行测定,略有调整。取5 mL果汁用95%(v/v)乙醇定容至20 mL并在沸水浴上加热30 min,随后在5000×g下离心10 min,取沉淀后加入40 mL去离子水再在50 ℃下水浴30 min并抽滤,滤液定容至50 mL测定可溶性果胶;同时,抽滤后的沉淀加入100 mL 0.5 mol/L硫酸溶液,沸水浴1 h后冷却并定容至100 mL测定原果胶。原果胶和可溶性果胶含量加和即为总果胶含量。

1.2.5.4 抗坏血酸含量测定 取2 mL果汁加入7 mL 5%(w/v)TCA溶液充分混匀,采用邻菲罗啉比色法[9]测定样品中抗坏血酸含量,结果以μg/mL表示。

1.2.5.5 总酚和柠檬苦素含量含量测定 取10 mL果汁加入20 mL含0.2%(v/v)甲酸的冷丙酮,充分混匀后于12000×g下离心20 min(4 ℃),收集上清液用蒸馏水定容至50 mL备用。

总酚含量参考Flion-Ciocalteu法[10]进行测定,结果均以μg/mL表示。柠檬苦素含量的测定参照陈静等[11]方法,使用安捷伦1100系列HPLC进行测定。相关参数:色谱柱reverse Nova-Pak C18分析柱(250×4.6 mm i.d.,10 μm),流动相为乙腈-四氢呋喃-水(体积比为17.5∶17.5∶65),流速0.5 mL/min,柱温30 ℃,进样量为10 μL,在207 nm的检测波长下应用外标法定量分析提取液中柠檬苦素含量,结果以mg/mL表示。

1.3 数据处理

以上各指标均重复测定3次,整个实验重复2次。数据均以平均值±标准误差(means±SE)表示,用Origin 8.5软件作图。运用SAS 8.2软件对数据进行处理,使用Duncan多重比较法分析差异显著性(5%水平)。

2 结果与分析

2.1 柠檬原果汁琼脂絮凝澄清工艺的优化

柠檬果实榨汁后细胞壁碎片和析出的多糖、脂肪和蛋白质类成分会使果汁悬浮物含量上升,造成果汁色泽黯淡和粘度上升。琼脂属于有机大分子类物质,在果汁中适量添加具有絮凝沉淀不溶物,提高澄清度的作用[12]。由交互试验表5可知,当絮凝时间大于55 h且琼脂添加量超过0.2%时,柠檬果汁的澄清度无明显增加。因此,为兼顾澄清汁透光度的工艺需要以及降低操作流程的物料成本,选择当琼脂粉添加量为0.2%,絮凝时间55 h时,作为柠檬鲜榨果汁琼脂絮凝澄清工艺的最优参数。

表5 柠檬原果汁琼脂絮凝澄清工艺交互试验结果Table 5 Results of interaction trials in clarification process of lemon raw juice by agar flocculation

2.2 柠檬原果汁酶解-吸附联用澄清工艺的优化

果胶酶和纤维素酶是果汁澄清操作中常用的水解酶,两者可特异性水解植物细胞壁中的果胶和纤维素[13];活性白土又名漂白土,是安全性较高的高效吸附剂,特别适用于吸附油溶性色素和杂质,而且活性白土可重复使用,材料成本较低[14]。表6为柠檬鲜榨果汁酶解-吸附联用澄清工艺的正交试验结果。由各因素不同水平间的极差R值可知,活性白土添加量对柠檬原果汁的澄清效果影响最大,其次为果胶酶和酶解时间。各因素最优水平组合为A3B3C2D3:即果胶酶添加量为0.3%、纤维素酶添加量为0.15%、酶解时间2 h、活性白土添加量为4%。

表6 柠檬原果汁酶解-吸附联用澄清工艺正交试验结果表Table 6 Results of orthogonal trials in clarification process of lemon raw juice by combination of enzymolysis and adsorption

2.3 柠檬原果汁酶解-絮凝联用澄清工艺的优化

壳聚糖为绿色的大分子多糖,其游离氨基易在水溶液中形成阳离子聚合体,可特异性吸附色素并且能通过鳌合作用清除金属离子,因此在果汁澄清操作中具有良好的应用潜力[15]。从表7中极差R值可知酶解-絮凝联用工艺对柠檬原果汁澄清效果的影响大小,壳聚糖添加量(C)>果胶酶添加量(A)>絮凝时间(D)>酶解时间(B);且各因素最优水平组合为A2B3C3D3。

表7 柠檬原果汁酶解-絮凝联用澄清工艺正交试验结果表Table 7 Results of orthogonal trials in clarification process of lemon raw juice by combination of enzymolysis and flocculation

2.4 柠檬原果汁细胞冻融破碎澄清工艺的优化

冻融是物理性的细胞破碎法,其主要通过反复冻融操作使细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞[16]。在本试验中,当速冻温度越低,柠檬果汁的澄清度越高;解冻温度对果汁澄清度的影响不显著(P>0.05)。因此,速冻温度为-30 ℃,解冻温度为10 ℃可作为细胞冻融破碎法的最佳工艺(见表8)。

表8 柠檬原果汁细胞冻融破碎澄清工艺交互实验Table 8 Results of interaction trials in clarification process of lemon raw juice by freezing and thawing

2.5 四种澄清工艺对柠檬原果汁品质的影响

柠檬原果汁经上述四种澄清工艺处理后的品质参数如表9所示,其中各工艺中参数均为上述优化的最优工艺,结果显示,四种澄清处理均可显著降低柠檬原果汁中果胶含量,提高透光度,其中酶解-吸附联用和酶解-絮凝联用的澄清效果较琼脂絮凝法和细胞冻融破碎法更为显著(P<0.05)。澄清操作对柠檬果汁中可滴定酸、抗坏血酸和柠檬苦素含量无显著(P>0.05)影响,但却降低了果汁中可溶性固形物和总酚含量。因此,酶解-絮凝联用和酶解-吸附联用对柠檬原果汁可起到较好澄清效果,其中酶解-吸附联用效果更优。

表9 四种澄清工艺对柠檬果汁品质的影响Table 9 Effects of four clarification processes on quality of lemon juice

2.6 柠檬清汁在不同温度贮存下柠檬苦素含量的变化

柠檬原果汁以及经琼脂絮凝法、酶解-吸附联用、酶解-絮凝联用或细胞冻融破碎法等澄清工艺制备的柠檬清汁中的柠檬苦素含量随贮存时间的延长均呈现逐渐降低趋势,说明柠檬苦素存在明显的自然降解现象(图1～图5)。

图1 柠檬原果汁中柠檬苦素在不同温度贮存期间的含量变化Fig.1 Changes of limonoids contents in the lemon raw juice during the storage under different temperatures

图2 经琼脂絮凝法澄清的柠檬清汁中柠檬苦素在不同温度贮存期间的含量变化Fig.2 Changes of limonoids content in the lemon juice clarified by agar flocculation during the storage under different temperatures

图3 经酶解-吸附联用法澄清的柠檬清汁中柠檬苦素在不同温度贮存期间的含量变化Fig.3 Changes of limonoids content in the lemon juice clarified by combination of enzymolysis and adsorption during the storage under different temperatures

图4 经酶解-絮凝联用法澄清的柠檬清汁中柠檬苦素在不同温度贮存期间的含量变化Fig.4 Changes of limonoids content in the lemon juice clarified by combination of enzymolysis and flocculation during the storage under different temperatures

图5 经冻融细胞破碎法澄清的柠檬清汁中柠檬苦素在不同温度贮存期间的含量变化Fig.5 Changes of limonoids content in lemon juice clarified by freezing and thawing during the storage under different temperatures

表10 柠檬清汁中柠檬苦素降解速率常数(k)和活化能(Ea)及模型验证Table 10 Degradation rate constant and activation energy of limonin in clarified lemon juice and model verification

3 讨论

果实经过压榨可得到原果汁,但在加工过程中会产生碎裂的果肉、果皮以及籽粒,并且由于果实细胞破碎会释放出多糖(淀粉或糊精)、蛋白质、果胶和(半)纤维素等大分子物质,这些杂质溶入果汁形成难去除的胶体物质,从而造成果汁颜色黯淡、混浊,严重降低鲜榨果汁的市场接受度[17]。在原果汁中加入多糖类(如壳聚糖、琼脂和羧甲基纤维素钠等)、蛋白类(如明胶、白蛋白和酪蛋白等)、吸附剂(如白土和活性炭)或水解酶(如果胶酶、淀粉酶和纤维素酶)等澄清剂或采用膜过滤和冻融等物理方法可有效降低果汁中的悬浮物含量并提高透光度[18]。饶炎炎等分析了壳聚糖、明胶、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、果胶酶和皂土五种材料对树莓汁澄清效果,发现五种澄清剂均具有较好的澄清效果[19];在物理方法方面,采用超滤膜或聚偏二氟乙烯膜(PVDF)可过滤掉鲜榨杨梅汁[20]和石榴汁[21]中的蛋白和多糖类不溶物,提高果汁澄清度。低温冻融方法也可显著降低蚕砂提取液中可溶性蛋白和多糖含量,提高提取液澄清度[22]。但单一澄清工艺同时也存在效率不高的缺点,采用多种工艺联用可更有效提高果汁澄清效果。本研究使用琼脂絮凝法、酶解-吸附联用、酶解-絮凝联用和细胞冻融破碎等四种澄清方法对柠檬NFC原果汁进行处理,均可得到柠檬清汁产品,透光度较原果汁显著(P<0.05)增加;酶解-吸附联用法处理的澄清效果要显著(P<0.05)优于其他三种方法,但此方法也造成柠檬清汁中可溶性固形物和总酚含量的显著(P<0.05)降低。这说明,酶解-吸附联用法在提高柠檬NFC原果汁澄清度的同时,也存在造成果汁感官品质及功能性物质损失的可能性。这主要是由于柠檬果汁呈酸性,壳聚糖和琼脂等多糖类澄清剂在此环境中带正电荷,从而能够特异性吸附果汁中果胶、鞣质和纤维素组成的带负电的胶体物质,不容易破坏释放游离氢后带正电的酚类以及含柠檬苦素类物质[15];而活性白土比表面积大且具有阳离子交换性,因此对带正电大分子有机化合物具有较强清除能力,易造成酚类含量的下降[23]。与本研究结果相类似,使用蛋白类澄清剂处理石榴汁后,果汁中酚酸和花色苷含量以及抗氧化活性明显下降[24]。因此,在果汁澄清操作中,澄清剂的选择需考虑果汁澄清与功能性物质维持的关系。

柠檬苦素为高含氧的三萜类化合物,保健功能较强;同时,柠檬苦素也是鲜榨橙汁类产品中的主要呈苦物质,在加工过程中需去除操作以改善口感[25]。但柠檬果实由于自身极为酸涩的感官特性,其NFC果汁主要定位为调味代替品或其他饮料原料,因此期望在产品中保留一定的柠檬苦素含量以提升产品营养价值。本研究利用动力学方程来预测柠檬清汁中柠檬苦素含量在贮存期间的含量变化。结果显示,柠檬果汁或清汁在不同温度贮存期间(278.15～303.15 K),柠檬苦素含量与贮存时间符合一级动力学方程。澄清处理未对柠檬果汁中柠檬苦素含量造成明显影响,但经澄清处理的柠檬清汁中柠檬苦素含量的k值显著高于柠檬鲜榨原汁,且经Arrhenius方程计算得到的清汁中柠檬苦素Ea也明显低于原汁水平,说明澄清处理对后续柠檬清汁在贮存期间的柠檬苦素具有一定破坏作用。这其中,经酶解-吸附联用法澄清得到的柠檬清汁中柠檬苦素在贮存期间Ea显著(P<0.05)低于经琼脂絮凝法、酶解-絮凝联用和细胞冻融破坏处理的产品,表明柠檬NFC原果汁经酶解-吸附联用法澄清得到的柠檬清汁在贮存期间柠檬苦素降解所需能级较小,降解速率快,不利于其含量的维持。这可能与活性白土非特异性选择吸附性有关,但相关机理仍待进一步研究。

4 结论

琼脂絮凝法、酶解-吸附联用、酶解-絮凝联用和细胞冻融破碎等四种澄清方法均可明显改善柠檬原果汁的透光度,具有明显的澄清效果;综合考虑其各工艺澄清效果及果汁澄清后的品质,酶解-吸附联用法处理的澄清效果要明显优于其他三种方法。

柠檬果汁琼脂絮凝澄清法的最优参数为琼脂粉添加量0.2%,絮凝时间为55 h;酶解-吸附联用工艺最优参数为果胶酶用量0.3%,纤维素酶用量0.15%,酶解时间2 h,活性白土用量为4%;酶解-絮凝联用最优工艺产生为果胶酶用量为0.2%,酶解时间4 h,壳聚糖用量0.12%,絮凝时间2.5 h;冻融细胞破碎法最优参数为冷冻温度-30 ℃,解冻温度10 ℃。

经琼脂絮凝法、酶解-吸附联用、酶解-絮凝联用和细胞冻融破碎等四种澄清方法处理的柠檬清汁在贮存过程中,柠檬苦素降解速度明显加快,不利于其含量的维持。