电子烟雾化剂丙三醇90 天大鼠吸入毒性研究

严大为，高峄涵，盛云华，梁德民，胡玥， 郑赛晶

1 上海新型烟草制品研究院，基础研究室，上海浦东新区秀浦路3733号 201315；

2 上海市食品药品检验所，药理毒理室，上海浦东新区张衡路1500号 201203；

3 上海烟草集团有限责任公司，技术中心，上海浦东新区秀浦路3733号 201315

丙三醇（Glycerol，俗称甘油，CAS 号：56-81-5）是一种无色、透明、无臭、味甜的粘稠液体，由于其具有保湿、塑化、调味、增稠、防腐等功效，在烟草、化妆品、涂料、纺织、食品和医药等行业有着广泛的应用[1]。在传统卷烟制品中通常使用1%～5%的丙三醇作为保湿剂和烟用香精香料的表面活性剂[2]。

近年来，随着新型烟草制品的兴起，丙三醇已经成为烟用原料中重要组成部分，尤其在电子烟中，丙三醇常作为电子烟烟液的雾化剂，含量可高达90%以上[3]。因此，关于丙三醇毒性的研究也变得尤其重要。丙三醇作为食品添加剂，它的经口毒性已经有相关报道。例如，文献报道丙三醇大鼠经口途径的LD50值为25 g/kg，经口毒性相对较低[4]；除此之外，在重复剂量试验中，按照10 g/kg 剂量对小鼠进行持续经口染毒25周，也未发现明显的毒性效应[5-6]。然而，关于丙三醇雾化吸入毒性的研究还比较少，迄今为止，只有Greenspan 和Renne 课题组对丙三醇的雾化吸入毒性进行了相关的报道[7-8]。Greenspan 等人将大鼠分别暴露在1 mg/L、2 mg/L 和4 mg/L 的丙三醇气溶胶中2 周，未发现摄食量、血液学和主要器官受到丙三醇的毒性作用[7]。Renne 等人将SD 大鼠口鼻分别暴露在0 mg/L、0.033 mg/L、0.167 mg/L、和0.662 mg/L 的丙三醇气溶胶中，每天6 小时，每周5 天，持续13 周，试验结果表明丙三醇对上支气管的上皮细胞造成轻度的刺激[8]。尽管Greenspan 和Renne 等人研究了丙三醇的雾化吸入毒性，但是丙三醇的浓度相对较低（≤4 mg/L），与市面销售电子烟气溶胶中的丙三醇最低浓度4.45 mg/L 仍有差距，然而关于高浓度、高剂量的丙三醇吸入毒性的研究还相对较少。由于电子烟烟液中雾化剂丙二醇和丙三醇的浓度和比例较高，且丙二醇前期已经做过相关研究[9]。因此进一步研究高浓度、高剂量丙三醇的吸入毒性十分必要，这也与消费者使用电子烟过程中大量吸入丙三醇气溶胶的安全性密切相关。因此，本文拟通过90天的口鼻暴露高浓度、高剂量的丙三醇雾化剂，研究其对Wistar 大鼠的吸入毒性作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与主要仪器

丙三醇（华宝食用香精香料（上海）有限公司）；Bayer ADVIA120 血球分析仪；Hitachi 7020 全自动生化分析仪；Easy Lyte Plus 钠钾氯分析仪；Sysmex CA1500 全自动血凝仪；Clinitek Status 尿液分析仪；MICROM STP 120 旋转式组织处理机；MICROM EC 350 组织包埋处理中心；MICROM HM 315 旋转切片机；MICROM HMS 740 自动组织切片染色机；IES-N 口鼻式吸入暴露系统；INTOX 粒径谱仪；高效毛细管气溶胶发生器（专利号：7114190，自制）； 玻璃纤维滤片（Borgwaldt KC Gmbh Schnackenburgallee）；37 mm 滤膜盒；Rnnova43 恒温摇床；CP224S 型分析天平；CASELLA 个体采样泵；TSE 流量计；Copley 真空抽气泵；Agilent1890 气相色谱仪。

1.2 试验动物与剂量设置

SPF 级Wistar 大 鼠120 只（ 北 京 维 通 利华试验动物技术有限公司，动物合格证号：11400700258487），雌雄各半，4～6 周龄，购入后在上海市食品药品检验所药理毒理室实验动物房适应性饲养一周，动物使用许可证号为SYXK（沪）2018-0016。试验期间饲养在温度（20～25）℃，相对湿度为40%～70%，12 小时光照/黑暗循环的条件下，提供充足的食物和水。本研究符合实验动物福利伦理原则，已通过上海市食品药品检验所实验动物管理和使用委员会的审查，编号为IACUCSIFDC17102。

本试验采用大鼠鼻吸入染毒来考察丙三醇气溶胶的毒性，设置阴性对照组和高、中、低剂量组，每组30 只动物，雌雄各半。根据预实验结果和相关文献数据，设置受试物高、中、低剂量组剂量分别为750 mg/kg、100 mg/kg、10 mg/kg，预设高、中、低气溶胶浓度分别为15 mg/L、2 mg/L、0.2 mg/L。丙三醇气溶胶浓度每日测定1 次，按照设定染毒剂量，并根据试验动物体重和测定的气溶胶浓度调整吸入染毒时间。阴性对照组吸入空气，吸入时间与受试物组中吸入时间最长的一组一致。每日将试验动物放入暴露塔中，进行分批暴露1 次，连续给予90 天，每周5 次，恢复期为28 天。吸入暴露时间可根据吸入剂量和气溶胶浓度计算得出，计算公式如下：

公式1：吸入剂量（mg/kg）=气溶胶浓度（mg/L air）×每分呼吸量（L/min）×暴露时间（min）/ 体重（kg），

每分钟呼吸量和体重的关系如下公式：

公式2： Vm= 0.499 BW0.809（R2= 0.975，BW：动物体重，Vm：每分钟呼吸量）[9]

在试验过程中，在动物鼻暴露的每个暴露口采样一次，计算丙三醇气溶胶的浓度（mg/L），每日气溶胶浓度监测值异常偏高或偏低则提示气溶胶暴露发生控制系统存在异常，则进行相应的调整，保证整个染毒周期气溶胶浓度的稳定性和均一性。

1.3 观察指标与方法

在90 天鼻吸入暴露期和28 天恢复期内，每天密切观察试验动物临床症状，包括一般状况观察、中毒情况与死亡情况，定期测量动物体重和耗食量，并进行眼科检查。

在第90 天暴露期和28 天恢复期结束后，采用代谢笼收集尿液进行分析，并进行大体解剖。解剖大鼠时，采用乌来糖按照1 g/kg 腹腔注射麻醉动物，麻醉后腹主动脉取血，分别取3 mL、2 mL 和3 mL 血液进行血常规、血凝和血生化的检测。解剖取材后，对取材组织或脏器进行大体观察和称重，然后固定于10%福尔马林固定液（眼球和睾丸固定于Bouin's 液）中，固定好后进行常规包埋、切片及染色进行组织病理学检查。肺部仅左肺放入固定液，右肺进行灌洗，收集肺泡灌洗液，测定灌洗液中总蛋白（TP）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）的含量，并对细胞分类和计数。

在进行组织病理学检查时，先对阴性对照组、高剂量组和尸检异常动物进行详细检查，如高剂量组动物某一组织发生病理改变时，再对其他剂量组动物的相同组织进行检查[10]。

1.4 数据处理与统计方法

体重、耗食量、脏器重量及脏器系数及临检的各项数据均属于定量数据，用±s 表示，并注明单位，对日常大体观察结果与组织病理学检查的结果，采用半定量的方式或文字表述。

统计软件为SPSS 19.0，按照以下程序统计：①首先进行Levene’s 检验，当P ＞0.05，则进行单因素方差分析（ANOVA）；当P ≤0.05，则进行Kruskalwallis 检验。②当ANOVA 结果显著（P ≤0.05），则进一步用Dunnett 检验进行多重比较检验；当ANOVA 结果无显著性差异（P ＞0.05），则统计结束。③当Kruskal-wallis 检验结果显著（P ≤0.05），则进一步用Kruskal-wallis 的单因素ANOVA 多重比较检验；当Kruskal-wallis 检验结果没有显著性显著（P ＞0.05），则统计结束。

2 结果

2.1 气溶胶浓度与粒径分析

试验期间通过气相色谱检测分析气溶胶样品， 试验大鼠吸入丙三醇气溶胶的浓度与设计值一致。丙三醇气溶胶质量中位数空气动力学直径（MMAD）均值分别为（0.76±0.17）μm、（2.02±0.37）μm、（2.65±0.50）μm；几何标准差（GSD）均值分别为5.38±1.10、3.18±0.63、2.68±0.30（详 见 表1），受试物高、中、低组平均吸入时间分别为83 min、93 min、71 min，丙三醇气溶胶颗粒可以被试验大鼠顺利吸入。阴性对照组吸入空气，吸入时间与受试物组中吸入时间最长的一组一致。

表1 试验期间丙三醇气溶胶浓度和粒径结果Tab. 1 Glycerol aerosol concentration and particle size during test

2.2 一般症状观察与眼检

试验期间大鼠染毒后均有不同数量动物出现眼周及鼻部出血，次日染毒前观察均恢复正常。试验期间，各组动物均精神状态良好，动物的毛色、行为活动、采食、饮水、二便、呼吸均未见明显异常。于试验开始前、试验染毒第8 周、第13 周和恢复期第4 周对大鼠进行眼科检查，试验大鼠眼球血管分布均匀、清晰可见、未见充血等明显异常（见图1）。

图1 雄性试验大鼠眼检图（A 阴性对照组；B 高剂量组）Fig . 1 Eye examination in male rats ( A: Control group; B: High dose group )

2.3 体重与耗食量

试验期间，与阴性对照组相比，恢复期第2 周和3 周，中剂量组雄性大鼠体重有所降低，但未见统计学差异，其余各剂量组雌雄动物体重均未见明显升高或降低（见图2）。

图2 试验期间雄性和雌性大鼠体重和耗食量情况，a) 雄性大鼠体重情况, b) 雌性大鼠体重情况, c) 雄性大鼠耗食量情况和d) 雌性大鼠耗食量情况Fig. 2 Change of body weight and food consumption of male and female rats in each group, a) body weight of male rats, b) body weight of female rats, c) food consumption of male rats and d) food consumption of female rats

染毒期间，与阴性对照组相比，雄性大鼠中剂量组摄食量略低于阴性对照组，其中第3 周耗食量明显低于阴性对照组（P＜0.05），具有统计学意义；雌性大鼠中、高剂量组摄食量略低于阴性对照组，其中高剂量组第6 和11 周耗食量明显低于阴性对照组（P ＜0.05），具有统计学意义（见图2）。

2.4 血液学指标

试验期间，仅恢复期雄性动物中剂量组，与阴性对照组相比，MCH（平均红细胞血红蛋白）水平上升（P＜0.05）；PLT（血小板数）水平下降（P ＜0.05）。剩余各组试验动物血液学各项检查指标均未见明显差异（P＞0.05），结果见表2 和表3。

2.5 血液生化学指标

与阴性对照组相比，染毒期和恢复期结束后，丙三醇暴露组中雌雄大鼠的丙氨酸氨基转换酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TB）、血糖（GLU)、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、肌酸磷酸激酶（CK）、钠离子浓度（Na+）、钾离子浓度（K+）和氯离子浓度（Cl-）等血生化指标，均未见明显差异（P＞0.05）。

检测数据见电子稿附表1，附表2。

2.6 尿液

染毒期与恢复期结束后，对试验大鼠的尿液中的尿糖、尿蛋白、尿胆红素、尿胆原、潜血、酮体、白细胞、尿亚硝酸盐、尿比重和pH 值等指标进行检测，与阴性对照组相比，恢复期低剂量组雄性动物尿比重高于阴性对照组（P ＜0.05），其他组未见明显差异；剩余指标为描述性指标，结果均为正常或阴性，详情见表4 和表5。

表2 对雄性大鼠血液学检查结果的影响（±s）Tab. 2 Effect of inhaled glycerol on hematology results in male rats (±s)

表2 对雄性大鼠血液学检查结果的影响（±s）Tab. 2 Effect of inhaled glycerol on hematology results in male rats (±s)

注：染毒期数据n=10，恢复期数据n=5，*与阴性对照组相比P＜0.05。

指 标 阴性对照组 受试物组高中低染毒期WBC /（×109/L） 4.35±0.81 3.96±1.38 4.00±1.01 3.86±0.80 RBC /（×1012/L） 8.49±0.20 8.54±0.72 8.56±0.55 8.29±0.25 HGB /（g/dL） 15.22±0.29 15.56±0.85 15.38±1.10 15.04±0.62 HCT /（%） 46.57±0.93 47.31±3.84 47.53±3.77 45.36±1.89 MCV /（fL） 54.87±1.29 55.42±1.81 55.52±2.11 54.73±1.26 MCH /（pg） 17.95±0.43 18.28±1.24 17.98±0.55 18.17±0.90 MCHC /（g/dL） 32.68±0.36 32.98±1.80 32.38±0.60 33.19±1.72 PLT /（×109/L） 1048±95 1003±86 973±112 935±100 Neut /（×109/L） 1.05±0.17 1.07±0.40 1.10±0.48 1.02±0.45 Lymph /（×109/L） 2.90±0.65 2.52±0.86 2.52±0.49 2.49±0.52 Mono /（×109/L） 0.19±0.05 0.17±0.08 0.19±0.09 0.20±0.08 Eos（×109/L） 0.06±0.02 0.06±0.02 0.07±0.03 0.06±0.01 Baso /（×109/L） 0.05±0.01 0.05±0.04 0.04±0.03 0.04±0.02 Retic /（×109/L） 191.5±32.7 218.1±38.8 227.9±38.8 189.4±19.1 APTT /（s） 12.8± 1.1 12.6± 0.8 13.2±0.8 13.0±1.5 Fbg /（g/L） 2.2± 0.2 2.2± 0.1 2.1±0.1 2.2±0.1 PT /（s） 10.0± 0.7 9.8± 0.4 9.9±0.7 9.6±0.2 TT /（s） 54.2±5.3 51.3± 3.8 53.1±5.3 51.6±3.3恢复期WBC（×109/L） 4.35±0.91 4.65±1.23 4.25±1.12 6.19±2.36 RBC（×1012/L） 8.65±0.30 8.50±0.45 8.39±0.38 8.73±1.09 HGB（g/dL） 15.24±0.62 15.50±0.48 15.64±0.62 15.56±0.84 HCT /（%） 45.76±1.93 46.40±1.30 46.52±2.00 45.86±4.94 MCV /（fL） 52.90±1.48 54.64±1.59 55.48±0.79 52.60±2.96 MCH /（pg） 17.62±0.43 18.22±0.63 18.68±0.26* 17.92±1.29 MCHC /（g/dL） 33.34±0.40 33.36±0.58 33.60±0.19 34.12±2.19 PLT /（×109/L） 1101±79 1102±92 922±40* 1164±152 Neut /（×109/L）） 1.27±0.13 1.39±0.73 1.07±0.38 2.29±2.20 Lymph /（×109/L） 2.69±0.75 2.80±0.50 2.86±0.75 3.36±0.72 Mono /（×109/L） 0.23±0.08 0.26±0.14 0.18±0.11 0.33±0.23 Eos /（×109/L） 0.08±0.03 0.09±0.04 0.07±0.03 0.08±0.01 Baso /（×109/L） 0.04±0.02 0.04±0.02 0.04±0.02 0.05±0.03 Retic /（×109/L） 239.0±30.5 262.6±13.0 239.9±36.7 260.0±45.1 APTT /（s） 18.0± 1.1 17.4± 1.4 17.9±2.0 17.3±1.7 Fbg /（g/L） 2.0± 0.1 2.0± 0.1 1.9±0.1 2.6±1.2 PT /（s） 9.2± 0.1 9.2± 0.2 8.9±0.2 9.1±0.1 TT /（s） 54.3±8.0 50.4± 3.6 53.0±8.5 58.5±8.2

表3 对雌性大鼠血液学检查结果的影响（±s）Tab. 3 Effect of inhaled glycerol on hematology results in female rats (±s)

表3 对雌性大鼠血液学检查结果的影响（±s）Tab. 3 Effect of inhaled glycerol on hematology results in female rats (±s)

注：染毒期数据n=10，恢复期数据n=5，*与阴性对照组相比P＜0.05。

指 标 阴性对照组 受试物组高中低染毒期WBC /（×109/L） 3.75±1.11 3.49±0.85 4.09±2.60 3.00±0.97 RBC /（×1012/L） 7.72±0.25 7.54±0.42 7.73±0.27 7.72±0.31 HGB /（g/dL） 14.55±0.54 14.64±0.36 14.73±0.51 14.48±0.64 HCT /（%） 43.70±1.12 43.27±1.40 44.10±1.33 43.74±1.77 MCV /（fL） 56.63±1.10 57.45±1.89 57.09±0.60 56.69±1.66 MCH /（pg） 18.87±0.58 19.46±1.32 19.08±0.32 18.78±0.62 MCHC /（g/dL） 33.31±0.57 33.84±1.41 33.46±0.39 33.11±0.37 PLT /（×109/L） 1103±208 992±154 1004±96 999±137 Neut /（×109/L） 0.99±0.37 0.73±0.29 0.80±0.28 0.64±0.26 Lymph /（×109/L） 2.48±0.79 2.47±0.64 3.03±2.37 2.14±0.77 Mono /（×109/L） 0.14±0.06 0.14±0.05 0.13±0.06 0.11±0.04 Eos /（×109/L） 0.06±0.02 0.08±0.03 0.06±0.01 0.05±0.01 Baso /（×109/L） 0.03±0.01 0.03±0.01 0.03±0.03 0.02±0.01 Retic /（×109/L） 241.7±23.8 227.0±37.7 253.6±70.1 228.5±47.5 APTT /（s） 14.9± 2.0 14.5± 1.0 16.8±4.2 14.7±1.0 Fbg /（g/L） 1.6± 0.1 1.5± 0.1 1.4±0.2 1.5±0.1 PT /（s） 8.9± 0.3 9.2± 0.4 9.2±0.4 9.0±0.4 TT /（s） 50.4±4.9 46.9± 3.9 47.5±6.5 51.0±2.6恢复期WBC /（×109/L） 2.84±1.01 3.38±1.12 2.67±0.61 2.70±1.49 RBC /（×1012/L） 8.20±0.42 7.98±0.56 8.10±0.50 7.95±0.34 HGB /（g/dL） 15.82±0.85 15.52±0.53 15.38±1.10 15.10±0.57 HCT /（%） 46.88±2.39 46.02±2.58 45.38±3.12 45.14±1.98 MCV /（fL） 57.26±1.21 57.74±1.09 56.06±0.63 56.80±1.20 MCH /（pg） 19.32±0.22 19.46±0.86 19.00±0.29 18.98±0.63 MCHC /（g/dL） 33.74±0.44 33.72±0.91 33.88±0.43 33.46±0.54 PLT /（×109/L） 892±81 925±139 928±146 1056±245 Neut /（×109/L） 0.75±0.31 0.72±0.11 0.57±0.10 0.65±0.54 Lymph /（×109/L） 1.83±0.73 2.34±0.99 1.87±0.52 1.81±0.84 Mono /（×109/L） 0.14±0.04 0.17±0.05 0.11±0.04 0.12±0.08 Eos /（×109/L） 0.05±0.02 0.05±0.02 0.06±0.01 0.05±0.02 Baso /（×109/L） 0.03±0.01 0.04±0.01 0.02±0.01 0.02±0.01 Retic /（×109/L） 261.5±23.4 271.2±38.4 234.2±32.0 250.4±30.8 APTT /（s） 17.3± 1.3 17.8± 0.8 17.6±0.6 18.8±4.0 Fbg /（g/L） 1.5± 0.2 1.3± 0.1 1.3±0.2 1.4±0.2 PT /（s） 8.4± 0.2 8.5± 0.1 8.4±0.1 8.3±0.2 TT /（s） 45.6±2.4 46.1± 3.6 46.7±3.6 46.9±7.0

表4 对雄性大鼠尿液的影响（±s）Tab. 4 Effect of inhaled glycerol on urine of male rats (±s)

表4 对雄性大鼠尿液的影响（±s）Tab. 4 Effect of inhaled glycerol on urine of male rats (±s)

注：染毒期数据n=10，恢复期数据n=5，**与阴性对照组相比P＜0.01。

指 标 阴性对照组 受试物高剂量组 受试物中剂量组 受试物低剂量组染毒期尿比重 1.012±0.003 1.013±0.002 1.015±0.006 1.013±0.006 pH 6.7±0.4 6.7±0.4 6.5±0.4 6.6±0.5恢复期尿比重 1.011±0.002 1.011±0.002 1.013±0.003 1.020±0.004**pH 6.8±0.3 7.0±0.0 6.9±0.2 6.6±0.4

表5 对雌性大鼠尿液的影响（±s）Tab. 5 Effect of inhaled glycerol on urine of female rats (±s)

表5 对雌性大鼠尿液的影响（±s）Tab. 5 Effect of inhaled glycerol on urine of female rats (±s)

注：染毒期数据中低剂量组n=9（由于意外串笼致怀孕后处死），其余n=10，恢复期数据n=5。

指 标 阴性对照组 受试物高剂量组 受试物中剂量组 受试物低剂量组染毒期尿比重 1.013±0.005 1.013±0.003 1.011±0.002 1.016±0.006 pH 6.2±0.4 6.3±0.3 6.4±0.4 6.4±0.6恢复期尿比重 1.014±0.004 1.020±0.006 1.014±0.004 1.016±0.008 pH 6.3±0.4 6.1±0.4 6.5±0.4 6.1±0.5

2.7 脏器重量

试验期间，染毒期中受试物高剂量组雌性动物肝脏重量、肾脏重量均低于阴性对照组（P＜0.01）；恢复期中受试物中剂量组雄性动物肺脏重量低于阴性对照组（P＜0.01），但雌雄试验大鼠的脏器系数（与体重的比值）均未发生显著性差异，结果见表6 和表7，以及电子稿附表3，附表4。

2.8 肺部支气管灌洗液

试验期间对雌雄试验动物各剂量组支气管肺泡灌洗液中TP（总蛋白）、ALP（碱性磷酸酶）、LDH（乳酸脱氢酶）、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞进行检测，与阴性对照组相比，染毒期各剂量组雄性大鼠的LDH、淋巴细胞和中性粒细胞比例均值略低，但在恢复期低剂量组雄性大鼠的LDH 和淋巴细胞比例均值略高，中性粒细胞比例均值略低，但未见统计学差异，其余指标均未见明显差异。检测数据见电子稿附表5，附表6。

2.9 组织病理学检查

试验结束后，将染毒期、恢复期的试验动物组织进行制片，对阴性对照组和受试物高剂量组大鼠的神经系统：大脑、小脑、脑干、脑垂体、脊髓、坐骨神经；循环系统：心脏、主动脉；呼吸系统：肺脏；消化系统：食管、小肠、大肠、肝脏、胰腺等消化腺；泌尿生殖系统：肾脏、睾丸、附睾、卵巢、子宫、乳腺；淋巴造血系统：脾脏、胸腺、淋巴结组织；内分泌及其他组织：甲状腺、甲状旁腺、肾上腺；眼球及哈氏腺优先进行病理检查，仅阴性对照组发现1 例心内膜下心肌细胞坏死，炎细胞浸润（++，中度）的病变，其余阴性对照组和受试物高剂量组动物组织均未见明显病理性改变（见图3）。

表6 对雄性大鼠脏器重量的影响（±s，g）Tab. 6 Effect of inhaled glycerol on the organ weight of male animals（±s，g）

表6 对雄性大鼠脏器重量的影响（±s，g）Tab. 6 Effect of inhaled glycerol on the organ weight of male animals（±s，g）

注：染毒期数据n=10，恢复期数据n=5，**与阴性对照组相比P＜0.01。

指 标 阴性对照组 受试物高剂量组 受试物中剂量组 受试物低剂量组染毒期脑2.0349±0.0758 2.0716±0.0768 2.0148±0.0570 2.0626±0.1163心脏 1.2606±0.1149 1.3289±0.0945 1.2746±0.0675 1.2540±0.0898肝脏 11.2431±0.9363 11.9248±1.2979 10.0655±3.3125 11.9106±0.9991肾脏 2.8848±0.2913 2.8879±0.2880 2.8055±0.2149 2.9052±0.3197肾上腺 0.0655±0.0121 0.0693±0.0152 0.0711±0.0114 0.0708±0.0065胸腺 0.3091±0.0658 0.2710±0.0478 0.2832±0.0917 0.3234±0.0693脾脏 0.8786±0.1163 0.8276±0.1268 0.8169±0.1232 0.8735±0.1442睾丸 3.6834±0.1637 3.7672±0.2496 3.6670±0.3084 3.6086±0.3640附睾 1.3665±0.1935 1.3990±0.1676 1.3558±0.1552 1.3527±0.1130肺脏 1.4945±0.0678 1.6844±0.2773 1.5508±0.1223 1.5231±0.1103恢复期脑2.0561±0.1311 2.0814±0.0620 2.0203±0.0745 2.1155±0.1116心脏 1.4187±0.2140 1.3748±0.1664 1.2244±0.1167 1.3669±0.1233肝脏 12.9954±1.2937 14.6627±4.4130 12.2081±2.0180 14.2923±1.3596肾脏 3.0250±0.3330 2.9062±0.4130 2.7076±0.2618 3.0503±0.1434肾上腺 0.0641±0.0080 0.0586±0.0042 0.0549±0.0114 0.0660±0.0109胸腺 0.3095±0.0456 0.3895±0.1154 0.3109±0.0980 0.3029±0.0500脾脏 0.9293±0.1203 0.9957±0.1005 0.8268±0.1659 0.9155±0.1017睾丸 3.7253±0.3243 3.3898±0.5278 3.4235±0.2400 3.7076±0.4177附睾 1.4855±0.0914 1.3254±0.1735 1.2622±0.1470 1.3673±0.1155肺脏 1.7475±0.1190 1.6808±0.1500 1.4641±0.1139** 1.6253±0.0630

表7 对雌性大鼠脏器重量的影响（±s，g）Tab. 7 Effect of inhaled glycerol on the organ weight of female animals（±s，g）

表7 对雌性大鼠脏器重量的影响（±s，g）Tab. 7 Effect of inhaled glycerol on the organ weight of female animals（±s，g）

注：染毒期数据中低剂量组n=9（由于意外串笼致怀孕后处死），其余n=10，恢复期数据n=5，**与阴性对照组相比P＜0.01。

指 标 阴性对照组 受试物高剂量组 受试物中剂量组 受试物低剂量组染毒期脑1.9596±0.1017 1.9000±0.0550 1.9659±0.0828 1.9336±0.1035心脏 0.8420±0.0698 0.7787±0.0445 0.8181±0.1114 0.8172±0.0456肝脏 7.7376±1.0083 6.6085±0.5793** 7.0386±0.7751 7.5695±0.4764肾脏 1.9550±0.1759 1.7629±0.0955** 1.9010±0.2054 1.8582±0.0756肾上腺 0.08648±0.0141 0.0841±0.0177 0.0932±0.0112 0.0857±0.0104胸腺 0.2711±0.1044 0.2366±0.0566 0.2462±0.0552 0.2955±0.0917脾脏 0.6085±0.0994 0.5401±0.0441 0.6444±0.1443 0.6174±0.0748卵巢 0.1482±0.0332 0.1260±0.0245 0.1348±0.0309 0.1347±0.0275子宫 0.5611±0.1518 0.5550±0.1987 0.5754±0.0714 0.4969±0.1037肺脏 1.1944±0.0599 1.2055±0.0665 1.2311±0.1198 1.1848±0.0781恢复期脑1.9049±0.0539 1.9714±0.0966 1.9839±0.0663 1.9917±0.0821心脏 0.8921±0.0594 0.8901±0.1019 0.9575±0.1078 0.9334±0.0909肝脏 7.6801±0.9590 8.7093±2.2700 7.6818±0.4111 7.9185±0.8986肾脏 1.9902±0.1613 1.9655±0.2397 1.8829±0.0601 1.8907±0.2099肾上腺 0.0848±0.0060 0.0815±0.0065 0.0813±0.0077 0.0838±0.0112胸腺 0.2985±0.0580 0.2904±0.0750 0.2683±0.0482 0.2860±0.0296脾脏 0.6684±0.1021 0.6648±0.0929 0.6210±0.0409 0.6686±0.1465卵巢 0.1319±0.0131 0.1471±0.0361 0.1385±0.0100 0.1569±0.0326子宫 0.4937±0.1556 0.5751±0.1173 0.5635±0.1690 0.5210±0.1137肺脏 1.2952±0.0720 1.2776±0.1715 1.3749±0.0643 1.3142±0.1225

图3 90 天吸入毒性大鼠部分组织病理切片Fig.3 Pathological section of tissue of rats with 90 days of inhalation

3 讨论

本实验气溶胶浓度每周测定1 次，滤膜法采样后经GC-FID 分析，计算气溶胶浓度，结果显示受试物低、中、高3 个剂量组气溶胶浓度分别为（0.24±0.05） mg/L 、（1.74±0.24）mg/L、（14.53±1.07）mg/L，RSD 分别为19%、14%和7%，整个染毒周期丙三醇气溶胶浓度的稳定性较为可靠，符合吸入毒性试验的设计要求[11]。

试验期间，动物初次染毒后均有不同例数动物出现眼周及鼻部出血，但于次日染毒前观察均能恢复，应为应激反应所致，且组织病理学检查结果显示眼部和鼻部未见异常，因此，丙三醇的吸入对鼻部均未产生明显的异常改变。

与阴性对照组相比，丙三醇气溶胶处理组动物体重在恢复期第2 和第3 周，中剂量组雄性大鼠体重有下降趋势，但第4 周回复正常。同时染毒期间雄性中剂量组和雌性中、高剂量组的摄食量长期略低于阴性对照组，但仅有第3、6、11 周出现统计学差异，且未影响动物体重，眼科检查也未见明显异常，因此认为丙三醇气溶胶对试验动物的体重、耗食量和眼睛未产生明显的毒性作用。

与阴性对照组相比，恢复期雄性动物受试物中剂量组MCH 水平上升（P＜0.05），PLT 水平下降（P＜0.05），但血液学指标的改变是散发性改变，未见相应的生物学或毒理学上的病理性变化。

染毒期受试物高剂量组雌性动物肝脏重量和肾脏重量均低于阴性对照组（P ＜0.01），恢复期受试物中剂量组雄性动物肺重量低于阴性对照组（P＜0.01），但结合其它剂量组发现不存在剂量效应关系，同时上述器官的脏器系数未发生显著性降低，肝脏和肺部组织病理学检查也显示无明显病变，因此认为丙三醇气溶胶在试验设计剂量下连续吸入暴露未对大鼠脏器产生明显的毒性。

肺泡灌洗液分析主要是根据肺部支气管灌洗液可溶性蛋白和细胞类别的分析，判断肺部的病变情况[12]。美国胸科协会官方指南界定的健康非吸烟者BALF 细胞构成的参考值范围为：巨噬细胞大于85%，淋巴细胞10%～15%，中性粒细胞小于或等于3%[13]。在本试验染毒期和恢复期收集各剂量组的大鼠支气管肺泡灌洗液，对灌洗液中的TP、ALP 和LDH 含量及细胞分类计数进行分析检测，受试物各剂量组与阴性对照组相比，仅雄性大鼠的LDH、淋巴细胞和中心粒细胞比例的均值在染毒期和恢复期发生一定程度的升高或降低，但未见统计学差异，且在正常范围之类，其余指标均未见明显差异，说明试验大鼠肺部未出现明显病变。但冯红敏等人研究气管内雾化给予体积分数20%丙三醇对大鼠肺部具有轻微刺激性[14]，Renne 等也发现长期低剂量吸入丙三醇对肺部具有轻微的刺激性[8]，这可能与气管内滴注染毒方式和大鼠的暴露时间存在差异有关。在进行组织病理学检查时，除阴性对照组一只动物心内膜下心肌细胞坏死，炎细胞浸润，其余阴性对照组及高剂量组受试动物心脏和其它剩余器官均未见明显异常。此例应为受试动物单发或偶发性的背景病变，与受试物毒性无明显相关性。

4 结论

Wistar 大鼠连续90 天经鼻吸入给予丙三醇气溶胶，剂量分别为10 mg/kg（受试物低剂量组）、100 mg/kg（受试物中剂量组）、750 mg/kg（受试物高剂量组），恢复期28 天。在本试验条件下，各受试物组中动物体重、耗食量、眼检、血液学、血液生化、尿液、脏器重量、脏器系数、支气管肺泡灌洗液检查，均未见与丙三醇相关的生物学和毒理学病变。大鼠鼻吸入丙三醇90 天，暴露剂量750 mg/kg 情况下未对大鼠产生明显的毒性作用。