非小细胞肺癌组织中miR-105、KIFC1的表达变化及其临床意义

李丹，朱静，吴君华，徐维国，陈明勇

绵阳市中心医院，四川绵阳621000

肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤，近年来肺癌发病率及病死率逐渐增高,严重威胁人类健康[1]。目前肺癌的治疗主要包括手术治疗、化疗及靶向治疗等，但中晚期肺癌患者远期生存率较低，5年生存率仅约20%[2]。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌最为常见的类型，约占肺癌所有类型的80%，但由于肿瘤具有较大的异质性，不同患者治疗的敏感性及预后差异较大[3]。因此，有必要深入研究NSCLC的病因及发生发展的分子机制，寻找具有临床意义的诊断治疗靶点。微小RNA(miRNA)是小的内源非编码RNA，近年来研究发现miRNA参与细胞增殖、迁移和凋亡过程，与感染、免疫及肿瘤等疾病密切相关[4]。miR-105基因位于Xq28，在胃癌[5]、肝癌[6]等多种肿瘤组织中均存在异常表达的现象，并且miR-105的异常表达参与促进肿瘤的恶性进展，与患者不良远期生存率有关。驱动蛋白家族成员C1(KIFC1)又称为HSET，位于6p21.32，在肝细胞肝癌[7]、食管鳞癌[8]中存在表达异常升高的现象，并具有促进肿瘤细胞恶性增殖和迁移的作用，有可能成为肿瘤的诊断治疗新靶点。本研究观察了NSCLC癌组织中miR-105及KIFC1的表达变化，分析两者与NSCLC患者临床病理参数的关系，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年6月～2019年12月绵阳市中心医院收治的NSCLC患者120例，男72例、女48例，年龄30～78(56.2±6.5)岁，腺癌75例、鳞癌45例，肿瘤直径<5 cm者67例、≥5 cm者53例，肿瘤分期Ⅰ期30例、Ⅱ期44例、Ⅲ期37例、Ⅳ期9例，肿瘤分化程度高分化33例、中分化40例、低分化47例，淋巴结转移49例、无转移71例。患者均接受手术治疗，术中留取绿豆粒大小的癌组织及癌旁组织(距离癌组织5 cm以上)，液氮速冻后，转运至标本库后置于-80 ℃冰箱保存。纳入标准：①经病理学检查明确诊断为NSCLC；②首次诊治，患者既往均未接受过放化疗、免疫治疗等治疗；③临床病理资料完整。排除标准：①合并感染性疾病、免疫系统疾病等；②合并其它器官恶性肿瘤；③合并心肝等严重器官功能不全。患者及家属均知情同意并已签署知情同意书，本研究经绵阳市中心医院伦理委员会审核批准通过。

1.2 NSCLC癌组织与癌旁组织中miR-105、KIFC1检测方法 采用qPCR法。取约100 mg组织标本，TRIzol法提取组织中总RNA，DEPC水稀释，分光光度计测定总RNA溶液的浓度及纯度。以总RNA为模板，按照TaqMan RNA反转录试剂盒说明书将总RNA反转录合成cDNA，并进行PCR扩增。引物序列如下：miR-105正向引物为5′-AGGACUCAAAUGCUCAG-3′，反向引物为5′-UCAAAUGCUCAGACUCCUGU-3′；内参基因U6正向引物为5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′，反向引物为5′-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3′；KIFC1正向引物为5′-TGAGCAACAAGGAGTCCCAC-3′，反向引物为5′-TCACTTCCTGTTGGCCTGAG-3′，内参基因β-actin正向引物为5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，反向引物为5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。总反应体系20 μL，包括2 μL cDNA，0.1 μL TaqDNA聚合酶、1 μL上下游引物、1 μL 20×SYBR GreenI及0.4 μL浓度为10 mmol/L dNTPs。miR-105 PCR反应条件为：95 ℃、30 s，95 ℃变性5 s、60 ℃ 退火34 s、72 ℃延伸10 s，共40个循环。KIFC1 PCR反应条件为：95 ℃、5 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火60 s、72 ℃延伸10 s，共40个循环。所有反应均在ABI7500实时定量PCR仪上完成。以2-ΔΔCt表示组织中miR-105、KIFC1的相对表达量。重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 NSCLC癌组织与癌旁组织中miR-105、KIFC1相对表达量比较 NSCLC癌组织组织中miR-105、KIFC1的相对表达量分别为0.52±0.11、2.16±0.25，癌旁组织中miR-105、KIFC1的相对表达量分别为1.13±0.16、1.23±0.15，两者相比，P均<0.05。

2.2 NSCLC癌组织中miR-105、KIFC1相对表达量的相关性 NSCLC癌组织中miR-105、KIFC1相对表达量呈负相关关系(r=-0.602，P<0.05)。

2.3 癌组织中miR-105、KIFC1相对表达量与NSCLC患者临床病理参数的关系 癌组织中miR-105、KIFC1相对表达量与NSCLC患者临床病理参数的关系见表1。由表1可知，NSCLC癌组织中miR-105、KIFC1相对表达量与肿瘤分期、组织分化程度有关(P均<0.05)，而与性别、年龄、病理类型、肿瘤大小及淋巴结转移无关(P均>0.05)。

表1 癌组织中miR-105、KIFC1相对表达量与NSCLC患者临床病理参数的关系

3 讨论

肺癌是最常见的人类恶性肿瘤之一，也是全球癌症死亡的主要原因，发达国家高于发展中国家[9]。

近几十年来，我国肺癌的发病率和病死率有所增加。在病理上，肺癌分为NSCLC和小细胞肺癌，NSCLC占所有肺癌病例的75%～80%。目前手术仍然是NSCLC患者最有效的治疗方法，有助于延长患者的生存时间[10]。但是，在早期阶段，NSCLC很少表现出明显的症状，很多患者在疾病中晚期被诊断出，手术治疗效果不佳。近年来，尽管在化学疗法、放射疗法和靶向疗法等方面均取得了进步，但晚期NSCLC患者的预后仍然很差，严重威胁患者生活质量及生命健康[11]。

miRNA的表达及功能失调与肿瘤、自身免疫等多种人类疾病密切相关。miRNA是一类天然的小非编码RNA，长度为18～22个核苷酸，能够转录后抑制其靶信使RNA的表达。单个miRNA可以通过特异性结合mRNA的3′-UTR区来调控数百种靶mRNA的表达，有望成为预测或早期诊断NSCLC的肿瘤标志物[12]。本研究中，NSCLC癌组织中miR-105的相对表达量为显著低于癌旁组织，目前其机制尚不清楚，可能与长链非编码RNA如LINC00261能够直接结合并抑制miR-105靶基因表达有关。研究[13]发现，肺癌中LINC00261表达升高，通过抑制miR-105，进而抑制下游FHL1基因的表达，促进肿瘤细胞的无限增殖。本研究结果表明，NSCLC癌组织中miR-105的表达与肿瘤分期及组织分化程度有关，表明癌组织中miR-105可能作为一种抑癌基因参与抑制NSCLC的发生发展。有研究[14]报道，miR-105能够直接抑制磷脂酰肌醇3激酶/AKT信号通路的传导，发挥抑制肿瘤细胞恶性增殖的作用，而肿瘤发生时miR-105表达降低，其抑癌能力降低，导致肿瘤的分期分级升高。

驱动蛋白超家族蛋白(KIFs)是一类运动相关蛋白，可以附着在微管上并沿微管移动，以运输细胞器、蛋白复合物和信使RNA。此外，许多KIF通过参与染色体和纺锤体的运动，在有丝分裂中发挥重要作用[15]。KIFs家族由45个成员组成，包括39个N-驱动蛋白、3个M-驱动蛋白和3个C-驱动蛋白。KIFC1是KIFs家族中唯一在哺乳动物细胞中具有负端定向运动的成员，它位于6号染色体的短臂上，有4个转录本，正向链上共有20个外显子。KIFC1参与许多生理和病理过程，是细胞内物质的交换并维持细胞存活的驱动力[16]。KIFC1是潜在的癌症生物标志物和癌症治疗的分子靶标[17]。本研究中，癌组织中KIFC1相对表达量显著高于癌旁组织，其机制可能是肿瘤细胞中转录因子TCF4表达增加，其能够结合KIFC1基因启动子区域并促进KIFC1基因转录，导致KIFC1表达升高[17]。此外，本研究中，癌组织中KIFC1表达与肿瘤分期及组织分化程度有关，表明KIFC1表达随着分期和组织学分级的升高而表达增加，与促进肿瘤发生发展有关。我们分析，其机制可能是KIFC1一方面促进Akt磷酸化，进而激活GSK3β信号通路，促进肿瘤细胞的增殖，导致肿瘤分期升高；另一方面，KIFC1促进转录因子Snail的表达，促进上皮间质转化等基因的表达，导致肿瘤进展，组织分化程度降低[18]。

本研究中，癌组织中miR-105的相对表达量与KIFC1的相对表达量呈明显负相关，因而推测两者可能存在相互调控的关系。有研究[19]通过双荧光素酶报告基因实验证实，KIFC1可作为miR-105的直接靶基因，miR-105结合于KIFC1的mRNA 3′-UTR区，降低mRNA稳定性，降低KIFC1表达，从而抑制肿瘤细胞恶性增殖及迁移等生物学行为。

综上所述，NSCLC癌组织中miR-105表达降低、KIFC1表达升高，两者负相关，miR-105、KIFC1表达与肿瘤分期及组织分化程度有关，共同参与NSCLC的发生发展，有望成为新的NSCLC诊断、治疗的肿瘤标志物。