肝样腺癌患者的癌组织甲胎蛋白、CAR-T靶点蛋白及白细胞分化抗原133表达观察

董小川，孙平

华中科技大学同济医学院附属协和医院，武汉430022

肝样腺癌是原发于身体肝脏以外的其他组织器官，同时具有腺癌和肝细胞癌样分化的一种癌[1]，主要发生于胃，偶见于肠道、肺、胆囊、胰腺、卵巢、回肠等[2～8]器官。可产生甲胎蛋白(AFP)的发生于胃的肿瘤有两种组织学类型：髓样癌型和分化较好的乳头状管状癌型，且髓样癌细胞在形态上类似于肝细胞癌[9]。Ishikura等[10,11]于1985年首先报道了1例胃腺癌细胞具有肝细胞癌样分化，且患者血清及肿瘤组织中均存在AFP升高，首次将这种具有腺癌和肝细胞癌样分化特征的原发性胃癌命名为胃肝样腺癌(HAS)。目前临床病理机构将具有肝样分化但并不产生AFP的一类肿瘤也归类于肝样腺癌，该类型肿瘤即使早期确诊，预后仍然不佳，5年生存率<10%，超过半数患者会在发病12个月内死亡[12,13]。目前国内外关于肝样腺癌的报道较少，且多为个案及小样本报道。临床中肝样腺癌患者发病率低，临床症状与普通型腺癌一致，明确诊断困难且预后较差。AFP及CAR-T靶点蛋白(Glypican-3)是目前临床常用的肝细胞癌标记物，白细胞分化抗原133(CD133)是一种干细胞标记物。我们观察了36例肝样腺癌患者癌组织AFP、Glypican-3及CD133的表达变化，并探讨其与临床病理参数的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年1月～2017年6月间华中科技大学同济医学院附属协和医院外科收治肝样腺癌患者36例，其中男性27例、女性9例，患者中1例发生于小肠的患者年龄为21岁，其余在42岁～72岁，平均58.4岁；主要临床表现与一般肿瘤性病变相似，无特异性；病变位于胃32例(11例位于贲门-胃底、15例位于胃窦、6例位于胃体)、小肠2例、乙状结肠1例、右下肺叶1例；分化程度为低分化31例、中分化5例；胃肠道肝样腺癌病理类型以溃疡型为主，肿瘤直径大小不一；27例肿瘤侵犯胃壁或肠壁全层，5例肿瘤侵犯至肌层，1例肺肝样腺癌患者的肿瘤已侵犯胸膜；13例区域淋巴结转移7枚以上(7～19枚)，21例区域淋巴结转移1～6枚，2例无淋巴结转移。患者术后病理确诊为肝样腺癌。另选择20例普通型胃腺癌患者，其中男性13例、女性7例，年龄24～81岁，平均51.3岁。将36例肝样腺癌设置为实验组，20例普通型腺癌设为对照组，每组病例选取肿瘤浸润最深的区域留取直径1cm，厚约2mm的癌组织，两组术前均未进行放化疗治疗，均行全胃癌根治术，并且病理分期相匹配，术后所有患者随访。本研究经本院伦理委员批准同意，纳入者或其家属签署知情同意书。

1.2 癌组织AFP、Glypican-3及CD133检测 采用免疫组化法。取两组手术标本，10%中性甲醛液固定，常规石蜡包埋，连续切片4 μm，HE染色后光镜下观察观察，免疫组化采用链酶抗生物素蛋白-过氧化酶(S-P)染色方法，Glypican-3一抗购自福州迈新生物技术公司，AFP一抗试剂盒鼠抗人单克隆试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，CD133单克隆抗体购于丹麦DAKO公司，SP免疫组化超敏试剂盒购于武汉博士德生物公司。染色和抗体稀释按照说明书进行。免疫组化过程中以磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照。所有切片经两名病理科医生独立随机观察具有代表性的视野，选取细胞结构清晰，着色明显并且在相应部位出现棕黄色着色的细胞。肝样腺癌癌组织排列类似肝细胞癌，呈梁索状，肿瘤细胞胞质丰富嗜酸性，AFP、Glypican-3及CD133阳性表达均位于细胞质，AFP及Glypican-3阳性表达多位于肝细胞样分化区域，CD133阳性在肝细胞样分化区域和普通型腺癌区域均有表达，未见组织特异性。镜下在疑似肝样腺癌的区域，选取10个高倍视野，观察染色细胞数，标本无着色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分，根据阳性细胞所占肿瘤细胞的比例判定为染色细胞数<10%为1分、11%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分；两者相乘结果0～3为(-)，4～6为(+)，>6为(++)。以(+)、(++)为表达阳性，计算阳性表达率。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行处理。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察组、对照组癌组织AFP阳性表达率分别为47.2%(17/36)、10.0%(2/20),Glypican-3阳性表达率分别为61.1%(22/36)、5%(1/20),CD133阳性表达率分别为52.8%(19/36)、35%(7/20)，与对照组比较，观察组癌组织AFP、Glypican-3阳性表达率升高(P均<0.05)。肝样腺癌组织病理结构及AFP、Glypican-3及CD133免疫组化图片见图1、2、3、4。

图1 肝样腺癌组织病理结构(HE染色；图A为×100,图B为×200，图C为×400)

图2 肝样腺癌组织Glypican-3免疫组化图片(HE染色；图A为×100,图B为×200，图C为×400)

图3 肝样腺癌组织CD133免疫组化图片(HE染色；图A为×100,图B为×200，图C为×400)

图4 肝样腺癌组织AFP免疫组化图片(HE染色；图A为×100,图B为×200，图C为×400)

不同病理参数的肝样腺癌患者癌组织AFP、Glypican-3、CD133比较见表1。CD133表达与肝样腺癌患者血清AFP升高密切相关(P<0.05)，AFP及Glypican-3表达与肝样腺癌患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤pTNM分期，肿瘤分型及血清AFP水平及预后均无关(P>0.05)。

表1 不同临床病理参数的肝样腺癌患者癌组织AFP、Glypican-3、CD133表达(例)

3 讨论

肝样腺癌是具有明显肝样分化特征的一种罕见肿瘤，此肿瘤主要发生于中老年人，男性发病率显著高于女性，伴或不伴普通型腺癌成分，显微镜下病理形态与原发性肝细胞癌相似。肿瘤发现时患者多已有淋巴结转移，预后不佳。 肝样腺癌可分布于多个器官，常见于胃。本研究中，肝样腺癌以胃部常见(32例)。临床表现与其他恶性肿瘤症状相比并无特异性，发生于胃肠道的多表现为消化道症状，如腹痛、腹胀、恶心、呕吐、黑便等，发生于肺的多表现为呼吸系统症状，如咳嗽、胸闷。胃肝样腺癌的发生机制不明确，发生通路及分子传导机制不清晰,胃和肝组织学均起源于胚胎早期的前肠,一些原发性胃癌由于组织分化异常,可向肝细胞分化。

肝样腺癌无论发生于何种器官，其共同的组织学表现是：具有肝细胞癌样形态，癌细胞体积大，多边形或卵圆形，胞质丰富而嗜酸性，胞核异型性明显，见大核仁，核分裂像易见。一些区域可见怪异核和多核的瘤巨细胞。癌细胞呈梁索状、巢状排列，间质内常见纤维血窦将癌组织分隔。除肝样区外，常可见不同程度分化的普通型腺癌区，两种形态相互移行[11]。本研究中，镜下形态完全为肝样腺癌者17例，肝样腺癌伴有普通型腺癌者19例，普通型腺癌成分以管状腺癌或乳头状腺癌为主。

肝样腺癌预后不佳，侵袭性强，生存期短，预后较一般普通型腺癌差，本研究中36例肝样腺癌均为进展期腺癌，本组病例中83.3%(30/36)在两年内死亡。

肝样腺癌临床诊断多以形态为基础,同时免疫组化辅助作为诊断肝样腺癌的标准，本组研究中，肝样腺癌标本组织中均有不同程度肝样分化特征，不同程度表达肝细胞分化的标记物，如AFP及Glypican-3，提示肝细胞分化标记物在诊断肝样腺癌中有重要的价值。在肝外病变中，尤其伴有肝样形态学特征的腺癌中可出现阳性反应，证实为肝样分化[14]。HE切片中较易见到肝样分化特征，常伴有淋巴结转移，预后较差。在临床诊疗过程中，如果碰到病理诊断确诊为转移性肝样腺癌,应仔细排查原发部位。因原发于胃的肝样腺癌最常见,消化道检查必须完善，提高诊治效果。

Glypican-3作为一种癌胚蛋白，除胎盘及胎儿肝脏外，Glypican-3在正常组织中不表达，Glypican-3过表达与不良预后相关。Glypican-3可能作为一种肿瘤标志物。本组研究中，未发现Glypican-3与患者预后的相关性，可能与纳入样本偏少相关。

此外，本研究中发现，肝样腺癌癌组织中CD133亦有表达。CD133最早发现时是作为一种分离CD34+造血干细胞的表面标志，目前作为干细胞表达标记物，已被证实在多种实体瘤中表达，其表达阳性的肿瘤细胞具有干细胞的特性(如高增殖能力，肿瘤侵袭转移等)[15]，其表达于细胞质及细胞膜表面，起调节细胞分化的作用[14]，其在正常胃黏膜组织中不表达。CD133的表达与血清AFP升高相关，临床血清AFP的升高被认为是肝细胞癌或肝样腺癌的重要早期诊断线索之一，目前已有研究[8,16,17]报道，AFP可使肿瘤生长加快，并发生淋巴及血道转移,因AFP本身是一种免疫抑制剂。而CD133目前通常被认为与微血管侵袭性及预后不良有关，故而CD133可能作为潜在的肝样腺癌预后的一个辅助指标，并为今后对肝样腺癌的治疗提供一个新的思路。随着医疗技术的发展，更深入的研究CD133在肝样腺癌中所起的作用及其与预后的关系，有助于延长患者的生存期，同时提高患者生存质量。但在此次研究中，CD133与肝样腺癌的患者生存情况无明显相关性，可能与本病发病率低，样本量较小有关。故而更进一步的确切研究有待于更多病例的积累及延长随访时间，以进行更深入的研究。

综上所述，肝样腺癌患者癌组织存在AFP、Glypican-3、CD133表达升高。AFP、Glypican-3可能参与了肝样腺癌的发生发展。AFP及Glypican-3可能作为辅助诊断肝样腺癌临床指标，而CD133可作为潜在提示肝样腺癌预后不良的因素之一。