胰腺十二指肠同源盒基因-1/神经生成素3信号通路在胰岛β细胞分化中的作用机制研究进展

洪洋，杨开明

大理大学基础医学院，云南大理 671000

糖尿病可分为1型糖尿病(T1D)和2型糖尿病(T2D)。T1D是自身免疫炎症介导的细胞凋亡导致胰岛β细胞丢失，最终导致胰岛素分泌减少。T2D是外周组织胰岛素抵抗可导致胰岛β细胞衰竭，进一步造成血糖升高。长期高血糖可导致糖尿病患者出现冠心病、肾病等并发症，严重危害患者身心健康。传统治疗方法治疗糖尿病效果不佳。Shapiro等[3，4]研究发现，胰岛移植治疗效果与胰岛的分离纯化率及存活率密切相关，且胰岛移植仅对T1D患者治疗效果较好。

胰腺内分泌细胞的发育过程，是由胰芽原始导管上皮干细胞分化为成熟的胰岛功能细胞的过程，包括三个阶段：第一阶段是α细胞的形成；第二阶段是β细胞的形成；第三阶段为内分泌祖细胞继续向胰岛细胞分化，使胰腺具有外分泌与内分泌两部分功能。有很多重要转录因子参与调控β细胞的分化与成熟[5,6]。目前胚胎发育中胰干细胞细胞谱系多样化的分子调控机制仍不明确。转录因子的异位表达可改变或反分化体细胞的命运，这个过程被称为细胞重编程。非β细胞重新编程为可产生胰岛素的细胞可能为T1D患者的胰岛β细胞再生治疗提供新的思路和方法。研究[7]发现，胰十二指肠同源盒基因-1(Pdx-1)、神经生成素3(Ngn3)、V-maf肌腱膜化纤维肉瘤癌基因同源物A(Mafa)是三种关键的β细胞分化转录因子，可在胰腺发育的过程中相互影响，将不同类型的细胞转分化为胰岛素阳性细胞。Zhou等[8]研究也发现，这三种转录因子的特定组合可将成年小鼠中已分化的胰外分泌细胞重编程为形态、功能相似的β细胞，其与内源性胰岛β细胞无本质区别，能分泌胰岛素来改善高血糖症。Pdx-1/Ngn3信号通路可促使β细胞分化，促进干细胞向β细胞分化和增殖，通过β细胞移植治疗T1D及晚期T2D，具有较好的临床应用前景。现将有关Pdx-1/Ngn3信号通路在胰岛β细胞分化中的作用机制研究进展综述如下。

1 Pdx-1在胰岛β细胞分化中的作用机制

β细胞特异性转录因子可调节胰岛素的合成和分泌，这些转录因子不仅受其他基因的表达调节，而且还受其他蛋白质的活性和翻译后修饰的调节。在胰腺内分泌部发育的调控信号网络中，Pdx-1/Ngn3信号各转录因子及其蛋白对Ngn3的调控是该信号的关键，在胰腺早期发育中，Pdx-1表达于各种胰干细胞，其是胰岛素转录因子也是同源域转录因子，是腺泡、导管和胰岛细胞发育的重要因素，在胰腺外分泌和内分泌干细胞中均有表达[9,10]。

Pdx1又称为胰岛素启动子因子-1(IPF-1)、胰岛素上游因子-1(IUF-1)或葡萄糖敏感因子。研究[11]发现，短暂的高血糖可促进大鼠血清Pdx-1基因表达，而持续的高血糖则明显抑制血清Pdx-1基因的表达。在胚胎发育早期，Pdx-1仅在E9.5和E12.5之间胰的原始导管的干细胞中表达[7,12]。Kodama等[13]研究发现，弹性蛋白酶Cre介导的Pdx-1失活，会导致胰发育过程中外分泌部细胞分化受损，弹性蛋白酶Cre介导的Pdx-1基因突变小鼠则表现出葡萄糖稳态降低，胰岛素分泌减少，可以看出 Pdx-1对胰的发育及胰各种细胞的分化有着重要作用，Pdx-1的消耗和减少会引起大鼠葡萄糖耐受不良。基因失活研究[14]证明了Pdx-1在胚胎发生过程中的关键作用，Pdx-1敲除的小鼠会出现胰发育不全、Bruner′s腺缺失和十二指肠乳头畸形。研究[15,16]发现，敲除Pdx-1基因的小鼠、绵羊会出现胰发育和功能障碍，进一步证明Pdx-1在胰早期发育和β细胞分化成熟中的关键作用，Pdx-1是胰发育和胰岛素基因转录的重要调控基因。

2 Ngn3在胰岛β细胞分化中的作用机制

Ngn3是对胰岛发育有重要影响的转录因子，Ngn3可始动内分泌祖细胞，使其分化为内分泌细胞。具有内分泌的胰岛细胞均来自瞬时表达高水平Ngn3的胰干细胞，Ngn3活性的丧失几乎消除了胰岛内分泌细胞的分化。小鼠胚胎发育中Ngn3表达从E11.5到E15.5达到峰值，Ngn3基因缺失的小鼠不能产生任何内分泌细胞，也不能表达胰岛素基因增强结合蛋白1(Islet1)、桩蛋白4(Pax4)、Pax6、神经细胞分化因子1(NeuroD1)等转录因子，而缺失 Pax6、NeuroD1、转录因子相关蛋白Nkx6.1 或Nkx2.2的胰组织中仍存在Ngn3基因的表达，提示Ngn3是最早表达的碱性螺旋环螺旋结构转录因子，它位于这些因子的上游，是内分泌细胞启动分化时所必需的转录因子，在促进胰内胚层细胞向内分泌细胞分化又能维持成熟胰岛细胞的功能[17]。在成熟胰岛细胞中，过度表达Ngn3可增强糖尿病患者胰岛内分泌功能。Ngn3作为内分泌干细胞标记，与Pdx-1基因联合可诱导非β细胞转分化为β样细胞，若Ngn3、Pdx-1与唯一一种β细胞胰岛素基因活化转录因子Mafa结合，其相互协同作用还可使多功能干细胞分化为胰岛素分泌细胞，但其潜在风险尚需要深入研究。

Ngn3蛋白的磷酸化或调节转录因子的翻译后修饰，能改变促进非β细胞向β细胞分化的微环境，提高β样细胞的分化率[18]。进一步实验[19]证明，去除生长因子对细胞周期的抑制可使Ngn3去磷酸化，促进β样细胞表达胰岛素基因，促进胰干细胞向内分泌细胞分化，表明抑制Ngn3的磷酸化可促进功能性β细胞的生成。Matsuoka等[20,21]发现，Mafa能增强Pdx-1将Ngn3阳性的内分泌干细胞重编程为胰岛素阳性细胞、将定型的胰高血糖素α阳性细胞转分化为正常阳性细胞的能力，同时Pdx-1和Mafa共同作用，促进α细胞转分化为胰岛β细胞，且单独的Pdx-1基因表达无法在体内将α细胞转化为胰岛β细胞，进一步说明，糖尿病细胞治疗时转录因子相互作用对 胰岛β细胞分化和增殖的重要作用。因此，人体胃、肠组织上皮等导管类器官，可作为功能性胰岛β细胞的可再生来源，在糖尿病的发生、发展和治疗的研究中发挥重要作用。

3 Pdx-1/Ngn3信号通路在胰岛β细胞分化中的作用机制

在复杂的Ngn3转录调控网络中，Notch信号通路可通过诱导Sox9表达来间接调控Pdx-1、Ngn3表达。Ngn 3基因启动子可被 Notch信号下游靶基因Hes1 阻遏蛋白抑制表达。Pdx-1可通过结合其他转录因子间接或直接激活Ngn3的表达等多条信号通路，随后的调控中，Ngn3又分别激活下游转录因子Islet1 、NeuroD1、胰岛素瘤相关蛋白1(Insm1)、Insm2，最后调控胰岛干细胞分化产生β细胞、α细胞、δ细胞、PP细胞和ε细胞等5种内分泌功能细胞[2,22,23]。

胰腺内分泌细胞亚型由转录因子的协同活性决定，这些由基因编码的蛋白作用于胰干细胞，表明Ngn3与胰岛各内分泌干细胞相互作用，与Ngn3下游基因表达构成的相关转录因子形成较复杂的调控网络，通使胰岛内分泌干细胞分化形成成熟的胰岛细胞。从Pdx-1/Ngn3信号通路的调控作用来看，Pdx-1是Ngn3基因的上游调控因子，可通过激活Ngn3的表达调控胰干细胞分化。在胚胎发育过程中，位于Ngn3上游的基因在遗传谱系追踪发现，Pdx-1基因在胰岛内分泌干细胞中可直接作用调节 Ngn3 表达。

Pdx-1可控制胰腺的早期胚胎发育和产生胰岛素的胰岛β细胞的后期分化，在胰腺早期发育过程中参与交叉调节转录因子网络来促进内分泌祖细胞的分化。Pdx-1突变的小鼠血清Ngn3以及性别决定区 Y 框蛋白9(Sry related HMG box-9，Sox9)、肝细胞核因子6(Hnf6)、Hnf1b和叉头框蛋白A2(Foxa2)等其他调节Ngn3基因表达的转录因子水平均降低[1,24]。而胰内分泌干细胞转录因子Insm2是Ngn3下游的直接靶基因，也是该信号通路的下游调控因子。在Pdx-1和Ngn3的协同作用下，调节Insm2的启动子，激活其表达。Insm2再通过上调胰岛干细胞分化的关键基因Pax6、Nkx2.2、Nkx6.1表达，从而进一步分化为各胰岛干细胞，随后再继续分化为成熟的β细胞胰岛β细胞。其中，Insm2基因受 NeuroD1和Ngn3调节，NeuroD1(编码神经源性分化因子1)是参与内分泌细胞谱系以及神经元发育的基本环螺旋转录因子。Ngn3直接激活的NeuroD1参与成熟胰岛细胞的维持和分化[25]。二者通过与Insm2 启动子的近端E盒结合，促进神经内分泌组织中Insm2的表达[26]。

NeuroD1杂合子基因突变会导致年轻型晚期糖尿病(maturity onset diabetes of the young 6，MODY 6)[27]。目前MODY 6是临床上异质性的单基因疾病，易感人群为青春期及<25岁的成年人，其特征是胰岛β细胞功能障碍，确诊时要与T1D和T2D鉴别诊断[28]。决定胰岛内分泌细胞命运的Ngn3及其直接靶基因如Insm2、Pax6、Nkx2同源框2(Nkx2.2)、Nkx6.1(NK6 Homeobox 1)在胰组织各种细胞中均有表达，基因敲除Insm2以外的靶基因均可影响胰内分泌细胞的分化和形成[13]。

3.1 Insm2 Insm2与Insm1是从胰岛细胞中分离出的两个同源基因，并且编码的蛋白有相似的蛋白结构。其在胰岛细胞中的表达受转录因子Ngn3及其靶基因NeuroD1的调节。Insm2在胚胎胰发育的内分泌细胞中表达，小鼠胚胎从E11.5到E13.5或孕8～20 周时在胎儿胰组织中达到表达峰值，并与Ngn3表达存在重叠。Insm2表达在E11.5到E13.5时瞬时增强，并在Ngn3 / NeuroD1转导的胰导管上皮细胞中被激活。

Cai等[29]使用瞬时转染实验以及染色质免疫沉淀(ChIP)技术分析了Insm2基因的5′上游区域，证明了Ngn3和NeuroD1是Insm2基因上游调控的激活因子。Wang等[30]采用CRISPR-Cas9方法制备纯合Insm2-/-小鼠，Insm2-/-小鼠空腹血糖水平高于野生型，葡萄糖耐量和胰岛素/ C肽水平均降低野生型。证明Insm2的缺失会减少葡萄糖刺激的胰岛素分泌和降低葡萄糖耐量，Insm2-/-小鼠中Insm1、Ngn3和NeuroD1的转录水平增加，表明Insm2参与神经内分泌组织的发育途径，该途径受转录因子Ngn3、NeuroD1和Insm1调控。

3.2 Pax6 Pax6是胰岛β细胞Insulin基因表达的直接激活剂，并维持成熟胰岛β细胞的功能和特性。缺乏Pax6可导致进行性致死性糖尿病。在胰岛β细胞中Pax6结合的基因在缺失后相应下调，这些被结合和调控的基因多半可在Pax6缺陷型胰岛β细胞中被激活，表明Pax6在胰岛β细胞中既起转录激活因子作用，又起阻遏作用，抑制Ngn3启动子、Ngn3的转录调节子的表达，或者抑制Ngn3调节剂Foxa2可发挥其阻遏作用。

Pax6可通过调节胰高血糖素基因及Mafb、cMaf和NeuroD1/Beta2基因的转录影响α细胞的功能[31]。成年小鼠中若 Pax6 缺失会导致β细胞的大量丧失以及α细胞的扩增，最终出现低胰岛素血症和高血糖症，α细胞出现的异常可能是β细胞重新编程或者旁分泌作用，导致Pax6缺乏症的独特代谢表现，即严重的酮症。Pax6还可直接结合并激活Pdx-1和Mafa基因启动子，三者协同作用可激活参与β细胞分化和功能的必需基因。

3.3 Nkx2.2 Nkx2.2属于哺乳动物NK2同源盒转录因子家族的成员，是胰和肠道神经内分泌分化的生物标记，是除σ细胞外所有胰岛细胞都表达的细胞因子，也是参与ε细胞分化的关键性转录因子[32]。纯合Nkx2.2无效突变的小鼠可患有糖尿病，可能原因为胰岛β细胞的分化被移植，表明Nkx2.2在胰岛β细胞的最终分化中发挥重要作用。ε细胞可调节胰岛β细胞的各种功能。ε细胞能分泌生长素释放肽，抑制胰岛素从胰岛β细胞的释放，有助于升高血糖水平，同时参与胰岛β细胞的生长和增殖，抑制胰岛β细胞凋亡[33]。

Nkx2.2与NeuroD1间的遗传相互作用可调控胰岛PP细胞和ε细胞的相对比例。Nkx2.2阻止NeuroD1的激活可导致α细胞的形成，反之则导致β细胞形成[16]。Nkx2.2还可通过直接与胰岛素启动子结合、与胰岛素基因激活复合物物理缔合及诱导调节胰岛素基因转录的其他蛋白质表达来发挥其功能。

3.4 Nkx6.1 Nkx2.2和 Nkx6.1都是α细胞命运决定因子Arx的直接转录阻遏物，Nkx2.2阻遏物活性的缺乏会导致小鼠β细胞向α细胞转化，抑制Arx表达可稳定β细胞的转化[34]。Nkx6.1可在Ngn3 阳性细胞系中表达，但最后仅在胰岛β细胞中持续表达。在β细胞分化前，Nkx6.1和Islet1通过直接转录机制拮抗内分泌前体中Arx的表达，阻止与Pdx-1协同合作的α细胞功能。此外，β细胞中Nkx6.1的失活，会导致β细胞同一性消失并转化为δ细胞，使β细胞具有δ细胞的特性，在β细胞分化后，α细胞和PP细胞特异性基因的表达就会通过独立于Nkx6.1的机制被抑制，表明Nkx6.1的特异性表达，是成熟β细胞的转录因子，能促进内分泌前体细胞向β细胞分化。

除了通过Arx抑制α细胞特异性基因外，Nkx6.1还可以将δ、PP和ε细胞的前体细胞重新分配在 β细胞谱系，诱导β细胞基因和抑制非β内分泌基因来促进 β细胞命运的选择[35]。缺少Nkx6. 1会导致β细胞形成与分化异常,说明维持着β细胞的正常功能需要Nkx6. 1的持续表达。随着β细胞分化，需要Nkx2.2来维持Nkx6.1的表达。在胰 β细胞形成中，Nkx6.1位于Nkx2.2的下游，介导了β细胞祖细胞的扩增和最终分化。可被Pax6基因激活表达[36]。

综上所述，Pdx-1/Ngn3信号通路是调控胰岛β细胞分化的重要信号通路。Pdx-1/Ngn3信号网络各基因依次有序的表达调控，能将胰干细胞通过基因的顺序编程分化为β细胞，随后由控制成熟胰岛细胞功能所需的转录因子网络来控制。对于胰干细胞分化调控信号的研究，对临床上糖尿病的生物治疗策略具有重要价值。目前研究发现参与胰岛细胞分化调控中的转录因子，能够将胰其它内分泌细胞和外分泌细胞重新编程而分化为β细胞，证实了胰岛β细胞的活性可通过胰组织其它细胞的可塑性而实现。全面认识胚胎胰发育以及胰岛形成过程的调控机制，在探索糖尿病的治疗尤其是细胞替代治疗将具有创新意义。