哮喘诱发过程中腹腔注射CpG寡核苷酸的小鼠肺组织病理及BALF和血清TSLP表达观察

王超,董晓艳,蒋鲲,朱丹颖,方永双,李孟荣

1上海市儿童医院，上海交通大学附属儿童医院，上海 200062;2 温州医科大学附属第二医院，育英儿童医院

支气管哮喘(简称哮喘)是儿童常见的呼吸道慢性疾病之一，严重影响儿童的生长发育及身心健康。哮喘的病因、发病机制及治疗方法一直是临床研究的热点。CpG寡核苷酸(CpG oligonucleotides，CpGODN) 是一类含有与微生物体内类似的、具有免疫活性的非甲基化GC序列单链脱氧寡核苷酸(ssDNA)片段的统称，具有广泛的免疫调节作用。多项动物实验[1～3]表明，CpGODN可诱导小鼠Th1型免疫反应，抑制Th2型免疫应答，可以有效地预防和治疗哮喘。胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是一种上皮源性细胞因子，与TSLP受体(TSLPR)结合而发挥生物学功能。越来越多的研究[4，5]结果表明，TSLP可能是启动哮喘和过敏症的关键因子，并介导过敏进程的发生、发展。CpGODN在哮喘中的具体作用机制目前尚不明确。CpGODN是否可以通过干预哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)及血清TSLP的表达变化，发挥其免疫调节作用？为此我们建立急性哮喘小鼠模型，观察CpGODN腹腔注射的急性哮喘小鼠BALF、血清TSLP的表达变化，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂 SPF级健康雄性Balb/c小鼠36只，4～6周龄，体质量18～22 g，购自中国科学院上海实验动物中心，于温州医学院实验动物中心层流实验室饲养，饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12h；CpGODN:硫代磷酸化CpGODN1826 (5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’)，上海生工生物工程有限公司；卵清白蛋白(OVA)、地塞米松(DXM)购自美国Sigma公司；TSLP酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海朗顿生物科技公司。

1.2 动物分组、哮喘诱发及CpGODN用法 36只小鼠(4～6周)随机分为4组，每组各9只。哮喘模型组(A组)、DXM干预组(B组)、CpGODN干预组(C组)用OVA致敏和激发建立小鼠急性哮喘模型：0.1%OVA/AL(OH)3混合凝胶0.1 mL于第1、14天腹腔注射致敏，第25～31天1%OVA雾化吸入激发，每日1次,每次30 min，连续7 d；B组激发前1 d和每次激发前1 h，0.5 mg/kg的DXM腹腔注射；C组激发前1 d和每次激发前1 h，50 μg的CpGODN腹腔注射。D组为正常对照组，每次致敏和激发均以生理盐水代替。在致敏阶段，第1次致敏后，各组小鼠表现无明显差异，在激发阶段，A组小鼠表现为烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐和二便失禁等症状，严重者呼吸减慢或节律不齐，动作迟缓或俯伏不动、四肢瘫软，反应迟钝；B、C组小鼠上述表现较A组明显减轻；D组小鼠均无上述症状。

1.3 各组小鼠肺组织炎症水平观察 末次激发24 h时，取各组小鼠，摘取眼球收集血液，2 000 r/min离心15 min，吸取血清-80 ℃保存。颈椎脱臼处死小鼠，打开胸腔，暴露肺组织，夹闭左肺门处，1 mL PBS缓冲液分3次于气管插管处注入，缓慢冲洗右肺，回收BALF，回收率约80%，2 000 r/min离心15 min，取上清液-80 ℃保存待检。左肺组织用4%多聚甲醛固定，制备石蜡包埋切片，苏木素一伊红染色用于光镜观察；同时取左肺组织，置预冷的2.5%戊二醛前固定，1%锇酸固定，常规方法处理，透射电镜观察肺组织超微结构。

1.4 各组小鼠BALF、血清TSLP检测 采用ELISA法。取各组小鼠BALF、血清，ELISA法检测TSLP，所有操作均严格按照试剂说明书进行。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在对数坐标纸上绘制标准曲线，用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代人方程式，计算出样品相对浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组小鼠肺组织病理改变 光镜下可见，A组小鼠肺组织炎症明显，支气管周围有大量的炎症细胞浸润，B、C组肺组织炎性细胞浸润减少，轻于A组，D组小鼠肺组织无炎症改变。电镜下A组小鼠肺组织超微结构改变明显，B、C组小鼠肺组织超微结构改变类似，均轻于A组，D组肺组织超微结构无明显改变。见图1、2。

图1 各组小鼠肺组织HE染色(×200)

注：A1为哮喘模型组肺泡腔内活化的巨噬细胞;A2为哮喘模型组肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体空泡化明显；B1为DXM组肺泡肺泡Ⅱ型上皮细胞微绒毛基本完整;B2为DXM组肺泡隔结构基本恢复正常;C1为CpGOND肺泡Ⅱ型上皮细胞结构基本恢复正常;C2为CpG治疗组电镜显示肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体基本恢复正常;D1、D2为对照组正常的肺泡Ⅱ型上皮细胞及板层体。图2 各组小鼠肺组织电镜图像(图A1、C2、D2×25 000,图A2、B1、B2、C1及D1×10 000)

2.2 各组小鼠BALF、血清中TSLP水平比较 A、B、C、D组BALF中TSLP水平分别为(2.481±0.152)、(2.263±0.122)、(2.483±0.191)、(2.483±0.280)pg/mL，与 A、C、D组比较，B组小鼠BALF中TSLP水平低(P均<0.05)。A、B、C、D组血清TSLP水平分别为(2.739±0.127)、(3.028±0.142)、(3.556±0.102)、(2.560±0.096)pg/mL，与D组比较，A、B、C组血清TSLP水平升高(P均<0.05)，A、B、C组间两两比较，P均<0.05。

3 讨论

TSLP由Friend等[6]于1994年首次报道，是一种新型的白细胞介素7(IL-7)样细胞因子，属于IL-2家族，主要由上皮细胞、气道平滑肌细胞、角质细胞、基质细胞、成纤维细胞、肥大细胞、巨噬/单核细胞、中性粒细胞及树突细胞(DCs)表达[7，8]。人TSLP编码基因位于5q21.1染色体，主要存在短型、长型2种同源异构体，前者有60个氨基酸组成，后者编码159个氨基酸[9，10]。鼠TSLP基因定位于第18号染色体，由140氨基酸组成。尽管人和鼠TSLP在基因和蛋白水平上仅有56%和43%的同源性，但其生物学功能却非常相似[11，12]。TSLP受体(TSLPR)属于造血细胞因子受体家族成员，功能性TSLPR复合物是由TSLPR和IL-7Rα组成。TSLP与其特异性受体TSLPR及IL-7Ra结合，形成三元复合物，启动信号传导[8]。TSLP-TSLPR-IL-7Rα复合体可作用于多种细胞系，特别是髓样DCs，上调DCs主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类、OX40配体(OX40L/CDl34L，CD252)、CD54、CD80、CD83和CD86以及激活标记物DC-LAMP的表达，促进DCs的成熟，从而诱导CD4+T细胞(Th0)分化为Th2细胞[13]，Th2效应细胞可分泌大量炎性因子(IL-4、IL-5、IL-9和IL-13)以及GM-CSF，促进B细胞生成IgE、肥大细胞脱颗粒和黏液高分泌，引起气道炎症和气道高反应性。Th2记忆细胞上MHC Ⅱ类相关抗原与B细胞受体结合，激活协同刺激分子CD40和CD40L，促进IgM向IgE转换。TSLP还可显著抑制Treg功能，导致抗炎细胞因子IL-10水平降低[14]。但经TSLP处理的DCs不产生促进Thl型细胞分化的细胞因子IL-12或促炎症因子TNF-α、IL-lβ和IL-6，这是TSLP构建Th2免疫微环境的关键特征[13]。研究发现，TSLP的基因启动区包含NF-κB结合位点，亦包含诱导TSLP表达的顺式调控元件，NF-κB结合位点是TSLP的启动子。在人气道上皮细胞中，促炎因子IL-lβ和TNF-α可通过NF-κB信号途径调节TSLP表达[15]；能使Toll样受体兴奋的因素即可通过NF-κB途径刺激内皮细胞产生TSLP[15，16]。本研究结果显示，哮喘组EILSA法检测BAFL中TSLP没有明显升高，与理论预计及Zhou等[5]研究献报道不符，考虑可能与造模有关及TSLPR的表达有关。哮喘组血清中TSLP明显升高，Zhou 等[5]也曾用EILSA法检测哮喘小鼠血清TSLP表达，但未检测出结果。王淑丽等[17]报道哮喘小鼠血清TSLP表达升高，究竟是局部TSLP影响血清TSLP表达，还是血清TSLP加重局部炎症反应，尚需进一步研究。

DXM是一种强有效的糖皮质激素，能抑制多种免疫效应细胞的功能，从而抑制各种细胞因子的合成与分泌。糖皮质激素与其受体结合后能降低NF-κB、AP-1活性，致促炎症因子如前列腺素、IL-1、IL-6、TNFa等表达减少，而抗炎症因子如IL-10、转化生长因子等表达增加，从而发挥糖皮质激素的抗炎等生物学效应[18]。Lee等[15]报道IL-lβ和TNFa能够诱导TSLP的表达和释放，进一步研究TSLP基因启动因，发现IL-lβ和TNFa可通过NF-κB途径活化TSLP启动基因，而加入核因子NF-κB阻滞剂后，TSLP表达明显减少。因此推测，DXM抑制TSLP的合成与分泌的机制可能是通过抑制IL-1、TNFa的合成，降低NF-κB活性实现的。本实验结果显示DXM组BAFL中TSLP明显降低，与其余三组相比，有显著性差异，提示DXM局部作用机可能是通过降低NF-κB活性，减少IL-lβ和TNFa分泌，从而抑制TSLP的表达。但DXM组血清中TSLP水平较A、B组明显升高，与小鼠致敏、激发时出现的症状不符，提示DXM和(或)TSLP全身同局部作用机制不同，为进一步研究DXM、TSLP在变应性疾病中的作用提供理论依据。

作为强有力的免疫反应刺激序列，CpGODN对哮喘气道炎症的抑制作用得到了广泛的关注。多个实验模型表明CpGODN具有预防及治疗哮喘的作用。CpGODN通过TLR9的特异性识别，可诱发信号传导途径，激活多种不同的转录因子，包括NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)，进而刺激B细胞增殖，诱导Th1型细胞因子如IL-12、IFN-γ、IL-6、TNF-α等的分泌，从而诱导Th1型免疫应答[1,19]。研究[15，16]发现，能使Toll样受体兴奋的因素即可通过NF-κB途径刺激内皮细胞产生TSLP。既然CpGODN可以活化TLR9，理论上即可激活NF-κB，应该可以升高TSLP表达，加重哮喘的症状，但是我们前面已述，TSLP构建Th2免疫微环境的关键特征，是经TSLP处理的DCs不产生促进Thl型细胞分化的细胞因子IL-12或促炎症因子TNF-α、IL-lβ和IL-6。Tomoki等[20]通过对静止DC、CD40L-DC、TSLP-DC基因表达谱的分析，发现TSLP能够诱导DC表达TNF超家族蛋白OX40L，后者通过与T细胞表面受体OX40相互作用，在没有IL-12的作用下促进Th2细胞的产生。当有IL-12存在时，OX40L不能诱导产生炎症Th2细胞，失去启动炎症Th2细胞产生的能力。CpGODN虽然可以通过激活NF-κB，诱导TSLP的表达，但是CpGODN可诱导Th1型细胞因子IL-12的分泌，使TSLP失去构建Th2免疫微环境的能力，不能产生以Th2为优势的免疫应答，由此可以推测CpGODN干预使小鼠哮喘症状减轻，部分机理可能是通过阻断TSLP介导的免疫应答实现的。在本实验结果显示，CpGODN组BAFL中TSLP无明显升高，同A组、B组比较无显著性差别，血清中TSLP升高明显，小鼠的哮喘症状反而减少，提示CpGODN局部同全身作用机制可能不同；CpGODN可能拮抗了TSLP的生物学作用。为CpGODN防治哮喘提供了新的理论依据及新的研究途径。

综上所述，腹腔注射CpGODN可减轻急性哮喘小鼠肺组织炎症水平，其机制可能为影响小鼠BALF、血清TSLP的生物学效应有关。哮喘的发病机制复杂，CpGODN在哮喘发病中的免疫活性作用可能存在多种不同的调节机制，彼此之间存在复杂的网络联系，与TSLP之间相互作用机制仍待进一步研究探讨。