米非司酮对人上皮性卵巢癌耐药细胞系SKOV3/DDP的增殖抑制、耐药性逆转作用观察

高宝荣,刘虹

1四川大学华西第二医院，成都 610041；2 天津市中心妇产医院

卵巢癌是女性三大常见的生殖器恶性肿瘤之一，以铂类为基础的联合化疗是目前临床治疗卵巢癌的主要方法。但卵巢癌细胞然而临床实践中发现化疗药物耐药是卵巢癌治疗效果不佳的主要原因[1]。降低或逆转卵巢癌癌细胞对化疗药物的耐药性一直是该领域的研究热点。米非司酮(mifepristone, MIF)是一种孕激素拮抗剂，目前临床将其用于胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和白血病等疾病的治疗中，具有抗肿瘤、逆转肿瘤细胞的耐药性等作用[2]。关于MIF在逆转卵巢癌细胞耐药方面的研究较少。2019年1月起，我们测算了MIF对人上皮性卵巢癌耐药细胞系SKOV3/DDP细胞的非细胞毒性剂量，以此为逆转剂量，观察加入逆转剂量MIF的SKOV3/DDP对顺铂(DDP)耐药情况，并初步探讨其可能作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3、SKOV3顺铂(DDP)耐药细胞系SKOV3/DDP购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所。MIF购自北京紫竹药业有限公司，DDP购自山东齐鲁制药公司。流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 SKOV3、SKOV3/DDP细胞培养 SKOV3、SKOV3/DDP细胞培养于含10%灭活小牛血清的RPMI-1640培养液中，37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，SKOV3细胞传代时间2～3 d，SKOV3/DDP细胞传代时间5～7 d。SKOV3、SKOV3/DDP细胞传2～3代后消化备用。

1.3 MIF对SKOV3/DDP的增殖抑制作用观察及逆转剂量选择 采用MTT法。取对数生长期的SKOV3、SKOV3/DDP细胞，调整细胞悬液浓度为6×104/mL，将该浓度细胞悬液接种于96孔板，每孔加入100 μL，培养24 h。SKOV3、SKOV3/DDP细胞分别分为实验组、空白组及对照组，实验组分别加入0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 μmol/L的MIF，每个浓度3个复孔，对照组正常培养，空白组只加入培养液。培养48 h时，每孔加入20 μL MTT溶液,继续孵育4 h。采用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值,测算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=OD实验组/OD对照组×100%。重复3次，取平均值。根据所测得OD值结果发现，0.625～40 μmol/L的MIF均可抑制SKOV3、SKOV3/DDP的细胞增殖，MIF浓度与细胞增殖抑制率的相关系数分别为0.779、0.881，呈线性相关，随着MIF浓度的增加，细胞的抑制率增加。绘制量-效曲线，选取SKOV3、SKOV3/DDP增殖抑制率均<5%的MIF浓度，并将此作为逆转剂量。

1.4 DDP对SKOV3/DDP细胞的半数抑制浓度及细胞耐药指数测算 采用MTT法,细胞培养及实验方法均同“1.3”。取适量SKOV3、SKOV3/DDP细胞，分别分为实验组、空白组及对照组，实验组分别加入100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 μg/mL的DDP,对照组正常培养，空白组只加入培养液。培养72 h时，加入20 μL MTT溶液,继续孵育4 h。采用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值,测算细胞增殖抑制率，进一步计算两种细胞对DDP的半数抑制浓度(IC50)，计算SKOV3/DDP细胞耐药指数(RI)。RI=IC50(SKOV3/DDP)/IC50(SKOV3)。重复3次，取平均值。

1.5 逆转剂量的MIF对SKOV3/DDP的耐药性逆转作用、细胞周期影响观察

1.5.1 逆转剂量的MIF对SKOV3/DDP的耐药性逆转作用观察 MTT法测算MIF对SKOV3/DDP细胞的耐药逆转倍数。取适量SKOV3/DDP细胞，分为A、B两组，A组加入RI剂量DDP,B组加入4.61 μg/mL的DDP+逆转浓度(5 μmol/L)的MIF ,细胞培养及实验方法均同“1.3”，分别于培养24、48、72 h时测算细胞IC50，计算MIF对SKOV3/DDP细胞的耐药逆转倍数(reversal fold, RF)。RF=IC50(DDP)/IC50(DDP+MIF)。

1.6 逆转剂量的MIF对SKOV3/DDP的细胞周期影响观察 取对数生长期SKOV3/DDP细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，接种于6孔板，加入5 μmol/L的MIF ，分别于培养24、48、72 h时收集细胞，预冷PBS洗涤细胞2次，加入预冷70%乙醇固定细胞，并吹打成细胞悬液，4 ℃固定过夜。2 000 r/min离心10 h，用PBS再洗涤细胞1次，加入500 μL的PBS[含50 μg/mL碘化丙啶(PI)，100 μg/mL Rnase A，0.2%Triton X-100]，4 ℃避光孵育30 min。用50 μm尼龙网过滤样品后上机检测，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析细胞周期。

2 结果

2.1 加入不同浓度MIF的SKOV3、SKOV3/DDP细胞增殖抑制率比较及MIF逆转剂量 加入不同浓度MIF的SKOV3、SKOV3/DDP细胞增殖抑制率比较见表1。进一步得到，MIF对SKOV3/DDP的逆转剂量为5 μmol/L。

表1 加入不同浓度MIF的SKOV3、SKOV3/DDP细胞增殖抑制率比较

2.2 DDP对SKOV3/DDP细胞的IC50及RI DDP对SKOV3、SKOV3/DDP的IC50分别为3.22、14.83 μg/mL，SKOV3/DDP细胞对DDP的RI为4.61。

2.3 MIF对SKOV3/DDP细胞耐药性的逆转作用 培养24、48、72 h时A组IC50分别为(23.13±0.83)、(14.83±0.52)、(10.07±0.56)μg/mL；B组分别为与(17.06±0.53)、(7.77±0.47)、(4.06±0.69)μg/mL，MIF对SKOV3/DDP细胞耐药性的RF分别为1.36、1.91、2.48倍。2.4 加入MIF的SKOV3/DDP细胞周期比较 培养24、48、72 h时，加入MIF的SKOV3/DDP细胞G0/G1期所占比例分别为48.7%、53.9%、55.1%、59.0%，S期所占比例分别为13.5%、9.6%、7.7%、5.8%，G2/M期所占比例分别为37.8%、36.5%、37.2%、35.2%。

3 讨论

卵巢肿瘤的病死率居妇科恶性肿瘤首位，手术联合化疗使晚期卵巢癌患者的近期生存率有了明显提高，但治疗后患者5年生存率仍为25%～30%。多数卵巢癌患者在治疗初始阶段对化疗较敏感，但是随着疗程的延续逐渐出现获得性耐药，如何逆转卵巢癌耐药对提高卵巢癌患者生存率至关重要。传统改善耐药性主要有两种方法：一是寻找对耐药细胞更为有效的抗肿瘤药物；另一种是通过增加细胞内的药物浓度逆转耐药性。

MIF作为一种孕激素和糖皮质激素受体拮抗剂，临床上主要作为一种计划生育类用药。近年来研究发现MIF还具有一定程度的抗肿瘤作用，可能与其诱导细胞凋亡、改变细胞周期等有关。Cui等[3]观察到在乳腺癌细胞MCF-7中，MIF能够阻断孕激素对凋亡抑制基因胰岛素样受体-2的上调，从而抑制癌细胞的生长。MIF还能够显著抑制体内移植瘤的生长，且在激素受体阴性的肿瘤中也具有相同的抑制作用[4～6]。不仅如此，在耐药的肿瘤细胞中，MIF也同样能够抑制肿瘤细胞生长的作用。Gamarra-Luques等[7]发现，卵巢癌细胞系IGROV-1及 SKOV-3经顺铂-紫杉醇耐药处理前后，它们对MIF均显示出相似的敏感性，这种敏感性以剂量相关的方式阻碍了它们的生长。本研究中也得到了类似的结论，我们所采用的SKOV3、SKOV3/DDP细胞系均为孕激素受体表达阴性的细胞系，且SKOV3/DDP为顺铂耐药细胞，经MIF作用后，两种细胞的生长均受到不同程度的抑制，呈剂量依赖性。

既往研究及本研究结果，均可看出MIF不同于强效的化疗药物，其对肿瘤细胞的抑制程度较低。因此，在基础和临床研究中，常将MIF作为一种增敏剂与细胞毒性药物或激素类药物联合，起到协同或增敏的效果[8]。Jurado等[9]在宫颈癌Hela细胞的体内、体外研究中发现，MIF联合顺铂作用于Hela细胞后，其细胞内顺铂的浓度较顺铂单独作用时增加了2倍，同样，裸鼠体内移植瘤中及血浆内顺铂的浓度也明显升高，药物的AUC曲线下面积及半衰期分别增加了17%和30%。研究[10]发现，MIF的代谢产物美他普利酮也具有类似的效果，可以增加细胞内药物的浓度，从而增加细胞毒性。这种增敏作用对于耐药细胞而言，在一定程度上能够起到逆转耐药效果。在其他肿瘤，如乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌等的耐药研究中均发现MIF具有逆转耐药的作用[2]。如Chen等[11]在宫颈癌的体外研究中发现，10 μmol/L的MIF可使Hela/MMC细胞对MMC的耐药指数从5.02降至1.46。国内刘国艳等[12]在卵巢癌顺铂耐药COC1/DDP细胞的体外研究中发现，随着MIF浓度的增加，COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性逐渐下降，且在10 μmol/L的水平时，耐药细胞对顺铂的敏感性可以达到并超过相应敏感株水平。国外研究[13]发现，5 μmol/L的MIF对卵巢癌细胞生长无影响，且能成功逆转耐药。本研究在MIF对SKOV3、SKOV3/DDP两种细胞的细胞毒性作用的量—效曲线中同样发现，5 μmol/L的MIF无论对耐药细胞还是非耐药细胞抑制率均<5%，且在耐药细胞中该浓度与低浓度组相比细胞抑制率无明显统计学差异，表明此浓度的MIF在耐药细胞中无直接抑制瘤作用，主要是通过改善肿瘤细胞对DDP的敏感性，逆转细胞的耐药性。在乳腺癌耐药MCF/ADM细胞中，黄俊辉等[14]发现逆转剂量5 μmol/L的MIF可将细胞对ADM的耐药指数下降约8.78倍。在将MCF/ADM细胞进行裸鼠体内移植形成移植瘤后，5 μmol/L的MIF与ADM联合使用时裸鼠体内移植瘤的体积显著低于单用ADM组的瘤体积。本研究也发现MIF作用于SKOV3/DDP细胞后，耐药指数下降，随着时间的延长，逆转耐药效果越强。

对肿瘤耐药逆转的研究归根结底要从耐药产生的机制上进行探索。以往关于MIF对肿瘤耐药性逆转的研究主要集中在耐药基因及相关耐药蛋白的表达上，如MIF能够诱导P-gp表达降低，抑制药物外排，逆转耐药。本研究则从凋亡的角度出发，探讨MIF对细胞周期调节的影响。耐药的肿瘤细胞常伴随着细胞周期从G1期到S期过渡的增加[15]。Gaddy等[16]发现MIF单独或与4-OHT联合作用耐药细胞系MCF-7.0.3及MCF-7.3.28后，与对照组相比，G1期比例明显增加，S期减少，细胞周期受阻于G0/G1期。本研究中，5 μmol/L的MIF作用于SKOV3/DDP后，随培养时间延长，细胞周期中G0/G1期所占的比例逐渐增加，S期所占的比例减少，表明细胞周期受阻于G0/G1期，这可能是MIF逆转卵巢癌耐药的原因。

综上所述，加入5 μmol/L的MIF可抑制SKOV3/DDP的细胞增殖，5 μmol/L的MIF可减轻SKOV3/DDP细胞对DDP的耐药性。MIF减轻SKOV3/DDP细胞对DDP的耐药性机制可能为MIF可将SKOV3/DDP的细胞周期阻滞于G0/G1期。