阴道正常菌群分布调查分析

韩丽媛 李 琳 安 新 王晓平

华北理工大学基础医学院 河北唐山 063210；①开滦总医院

健康女性阴道内有大量正常寄生菌，其通过自身分泌的粘附物质与阴道上皮细胞结合，定居于阴道黏膜表面。阴道内的微生态菌群、解剖结构、内分泌调节和区域免疫系统组成了女性阴道微生态体系。体内雌激素含量的变化、致病菌的侵入、长期服用抗生素等因素会破坏阴道微环境，引起菌群失衡，导致阴道感染的发生[1-2],并发如流产、人乳头瘤病毒(HPV)感染、肿瘤等严重后果[3-5]。近年来,女性阴道炎的发生频率日益增加，目前仍缺乏有效治疗手段。在控制感染的基础上，重建并恢复阴道微生态环境可为阴道感染的治疗提供新的思路[6-7]。本研究通过调查健康女性阴道正常菌群分布，筛选阴道微生态制剂候选种子菌，从而为女性阴道炎治疗提供实验基础。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2018年10月～2019年3月华北理工大学附属医院及唐山市妇幼保健院妇科体检中心体检者249例，年龄(30.16±10.28)岁，月经周期结束至少3天，体检前一周内未使用阴道药物，3天内无性生活。排除外阴瘙痒、阴道充血及阴道分泌物增多等阴道炎症状的患者。

1.2研究方法

1.2.1分泌物常规检查 以无菌拭子常规采集阴道分泌物，置于含1mL生理盐水的无菌试管内，沿管壁旋转挤压棉拭子，制备分泌物悬液。在清洁载玻片上涂片，盖上盖玻片后于高倍镜下检查。镜下观察上皮细胞、白细胞、阴道杆菌与杂菌的数量，划分清洁度。排除细菌、阴道毛滴虫及真菌感染的标本。阴道清洁度判断标准见表1。

表1 阴道分泌物清洁度判断标准

1.2.2细菌性阴道病联合检测 ①取出反应板平衡至室温；②将棉拭子在pH试纸上轻轻按压，使分泌物浸润试纸，待变色后立即判读；③使用微量吸管向反应板(珠海丽珠试剂股份有限公司)上每孔滴加一滴分泌物悬液；④向检测孔中分别滴加检测液，轻拍混匀。置35℃～37℃隔水恒温箱中温育15分钟，观察各反应孔的颜色变化。结果判读标准：①唾液酸酶检测：变蓝色或绿色为阳性，不变色为阴性。②过氧化氢检测：不变色为阳性，变蓝色或绿色为阴性。③白细胞脂酶检测：变蓝色或绿色为阳性，不变色为阴性。④pH检测：≤4.4为阴性，属于正常分泌物标本；>4.4为阳性，属于异常标本。

1.2.3细菌培养及生化鉴定 标本分别接种于血琼脂培养基、中国蓝培养基及淋球菌培养基(济南百博生物技术股份有限公司)。厌氧标本置于厌氧袋内， 37℃培养箱培养48小时。普通培养将培养基置于37℃、5% CO2培养箱培养18小时。观察各培养基上细菌生长情况，记录菌落大小、形状、颜色及溶血等指标。挑选优势菌落纯培养后使用细菌生化反应鉴定仪(法国生物梅里埃股份有限公司)进行鉴定，4℃保存菌种备用。

1.2.4实时荧光定量PCR鉴定 根据菌落观察及生化反应初步鉴定结果，选择相应引物，实时荧光定量PCR(济南欧莱博医疗器械有限公司)鉴定。选用荧光基团为SYBR Green Ⅰ，所选用的引物见表2。实时荧光定量PCR步骤：①将1000μL菌悬液于1200r/min，离心10分钟后弃去上清液；②向沉淀物中加入裂解液， 60℃水浴10分钟取出；③1200r/min离心10分钟，取上清液为模板进行PCR扩增。反应条件为：预变性95℃30秒，变性95℃5秒，退火和延伸60℃30秒，40个循环。

表2 引物序列

1.3统计学方法 所有数据采用SPSS 17.0统计学软件处理，计数资料采用行×列表χ2检验，检验水准取双侧α=0.05。

2 结果

2.1常规镜检结果 健康女性阴道分泌物标本在高倍镜下观察可见上皮细胞、杆菌较多，而白细胞偶见。阴道炎患者分泌物标本在高倍镜下观察可见上皮细胞、杆菌较少，而白细胞>15个/HP，见图1。249例健康体检女性阴道分泌物高倍镜镜检中， 有4例白细胞>15/HP，10例在高倍镜下发现孢子，故剔除。

图1 分泌物镜检结果注：(a)为健康女性分泌物镜检结果；(b)为阴道炎女性分泌物镜检结果

2.2细菌性阴道病联合测定试剂盒检测结果 235例标本中有1例标本唾液酸苷酶呈阳性，10例标本分泌物pH值>4.7，见表3。因不符合健康女性阴道分泌物标准，故剔除，将其余224例阴道分泌物标本进行细菌培养。

表3 235名健康女性阴道病联合测定试剂盒结果

2.3细菌培养及生化反应初步鉴定结果 224份健康体检者的标本中,经细菌培养及生化反应鉴定，分离嗜酸乳杆菌123株，分离率54.9%(123/224)；发酵乳杆菌98株，分离率43.8%(98/224)；棒状杆菌68株，分离率30.4%(68/224)；缓症链球菌37株，分离率16.5%(37/224)；表皮葡萄球菌32株，分离率14.3%(32/224)；马胃葡萄球菌28株，分离率12.5%(28/224)；粪肠球菌19株，分离率8.5%(19/224)。分离培养的主要细菌菌落见图2。

图2 分离培养主要细菌菌落注：(a)为嗜酸乳杆菌菌落；(b)为发酵乳杆菌菌落；(c)为棒状杆菌菌落

2.4实时荧光定量PCR鉴定结果 根据细菌培养及生化反应初步鉴定结果，选择引物利用实时荧光定量PCR进行基因鉴定，其中有1例发酵乳杆菌和9例棒状杆菌与细菌生化反应不一致,结果见表4。荧光定量PCR检测结果见图3，根据荧光定量PCR结果以直方图描述阴道正常菌群频数分布，见图4。根据阴道正常菌群频数分布，确定发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌及棒状杆菌作为阴道微生态制剂的候选种子菌。

表4 生化反应鉴定与实时荧光定量PCR鉴定各种细菌例数及比例

图3 健康女性阴道主要菌群PCR鉴定曲线(A嗜酸乳杆菌B发酵乳杆菌C棒状杆菌)

图4 阴道正常菌群频数分布

3 讨论

正常健康的微生态环境对于人体器官及系统、局部维持正常的功能非常重要。在感染、药物等因素的作用下，局部的正常菌群比例可能被破坏，引起菌群失调，由此带来的感染性疾病很难通过抗生素治疗进行纠正。因此在药物治疗过程中，如果能够应用微生态制剂重建局部的微生态环境，可以为菌群失调所导致感染性疾病的治疗带来新的思路。

本研究共收集健康体检女性阴道分泌物标本249例，经高倍镜检查以及细菌性阴道病联合测定，剔除25例样本，符合正常分泌物标准标本共224例。将224例标本细菌培养后生化反应初步鉴定,根据生化反应结果,选择相应引物应用实时荧光定量PCR进行分子生物学鉴定。结果表明在224例正常阴道分泌物标本中，分离率较高的细菌分别为嗜酸乳杆菌(123例，分离率为54.9%)、发酵乳杆菌(98例，分离率为43.8%)、棒状杆菌(59株，分离率26.3%)。

乳杆菌主要包括发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、加式乳杆菌、詹氏乳杆菌等[8-9]。阴道鳞状上皮细胞内的糖原经乳杆菌的作用分解成乳酸，使阴道的局部形成弱酸性环境。这种弱酸性环境不利于阴道内致病菌的生长。此外，乳杆菌通过替代、竞争排斥机制阻止致病微生物粘附于阴道上皮细胞，抑制病原菌的生长；同时分泌过氧化氢、细菌素等抑制致病微生物生长，从而维持阴道微生态的平衡。

棒状杆菌需氧或兼性厌氧， DNA中的G+C含量较多。寄生在人体的皮肤、黏膜等处。棒状杆菌属具有免疫激活及介导作用，短小棒状杆菌作为棒状杆菌的分支，具有多种生物活性及免疫激活能力，包括激活单核巨噬细胞、自然杀伤细胞，诱生干扰素、肿瘤坏死因子及白细胞介素等多种细胞因子的产生，具有调节免疫功能[10]。棒状杆菌通过寄生在阴道黏膜处，形成了天然的免疫屏障，达到阴道自洁的效果。此外，在224例标本中还分离到包括缓症链球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、粪肠球菌等其他细菌，但分离率较低。

本次研究结果表明，嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、棒状杆菌为健康女性阴道内的优势杆菌，在健康女性阴道中分离率较高，可作为阴道微生态制剂的候选种子菌株。