肺癌患者血清miRNA-4534水平和病理分期与预后的关系

杨寿艳 邓彬兵 孟雄 王兮 母前途

由于发现时多数肺癌患者已至中晚期、肿瘤细胞易耐药及肿瘤生物学行为复杂等原因，多数肺癌患者生存期较短［1］。微小核糖核苷酸（micro RNA，miRNA）是一种长度较短的单链RNA，它能够通过结合miRNA 的3′-端非编码区来调节靶基因的表达［2］。目前已知与肺癌相关的miRNA 有约40 种，与肺癌的发生、诊断、耐药性，治疗等方面有重要关联［3］。此前有研究通过深度测序，观察到miR-4534 在正常和恶性人类β 细胞中表达有差异［4］。然而，微小核糖核苷酸-4534（microRNA-4534，miRNA-4534）在肺癌患者中的表达、作用等尚不明确。基于此，本研究选取64 例肺癌患者作为研究对象，以探讨肺癌患者血清miRNA-4534 水平和病理分期与预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2016年6月间收治的64 例肺癌患者作为研究对象。肺癌患者纳入标准：①均经病理检查确诊为肺癌者，且均为原发肺癌患者［5］；②入组前未经放化疗、手术等抗癌治疗；③初发肺癌者；④年龄＞18 岁者。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②合并其他重要器官功能障碍。良性肺病者30 例包括肺炎14 例、肺结核8 例、炎性假瘤8 例，肺癌组：男性41 例、女性23 例，年龄39-85岁、平均年龄（60.52±9.50）岁。良性肺病组：男性17例、女性13 例，年龄34-72 岁、平均年龄（60.13±8.20）岁。选取同期体检健康志愿者30 例作为对照组，其中男性18 例、女性12 例，年龄27 岁～70 岁、平均年龄（60.84±6.74）岁。三组一般资料对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。所有患者均已取得知情同意，本研究已通过医院伦理委员会审核。

1.2 检测方法

使用柠檬酸钠抗凝管收集所有研究对象的外周血3 mL，4 ℃下放置，1 h 内3 000 r/min 离心10 min，收集上清液，-80℃冻存待测。使用Trizol 提取试剂（美国Invitrogen 公司，批号：1420087）从血清中提取总RNA，并使用反转录技术将其反转录为cDNA（反转录试剂盒购自日本Takara 公司，批号：RR047A），使用SYBR premix EX taq 试剂盒进行样品上样，然后在实时聚合酶链式反应（PCR）仪中对样品进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR，试剂盒购自日本Takara 公司，实时PCR 仪为美国ABI 7500型），每个样品设置三次重复孔。MiR-4534 的引物序列为正向引物：5′-GTGATTTATTTTTGTAAGT TTAGTATTTTGGGAG-3；反向引物：5′-ACAAA TACRTACCACCATACCCAA-3′。由日本Takara公司合成，U6 引物序列为正向引物：5′-CTCGCTT CGGCAGCACA-3′；反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。作为内参反应体系，使用2-ΔΔCt法计算miRNA 的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，偏态分布计量资料以（±s）表示，偏态分布计量数据以中位数［四分位间距（p25，p75）］表示，两组间对比行独立t检验或Mann-Whitney U 检验，多组间对比行Kruskal-Walls H（k）检验；计数资料以n（%）表示，行χ2检验；绘制ROC 曲线评估miRNA-4534诊断肺癌发病及患者预后不良的效能，采用pearson 法分析mirRNA-4534 与患者生存期的关系，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组间miRNA-4534 相对表达量对比

肺癌组miRNA-4534 相对表达量高于良性肺病组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），良性肺病组和对照组miRNA-4534 相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 3 组间miRNA-4534 相对表达量对比Table 1 Comparison of relative expression level of miRNA-4534 among the 3 groups

2.2 miRNA-4534 诊断肺癌的ROC 曲线

ROC 曲线显示，miRNA-4534 诊断肺癌发病的曲线下面积（AUC）为0.839（95%CI：0.777～0.931，P＜0.05），最佳临界值为2.52，敏感性76.56%，特异性98.33%，见图1。

2.3 miRNA-4534 相对表达量与肺癌临床病理特征的关系

不同性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、病理类型间miR-4534 相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），TNM Ⅲ/Ⅳ期肺癌患者miR-4534 相对表达量高于Ⅰ/Ⅱ期者，差异有统计学意义（P＜0.05），有淋巴结转移肺癌患者miR-4534 相对表达量高于无淋巴结转移者差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 miRNA-4534 相对表达量与肺癌临床病理特征的关系Table 2 Correlation between relative expression of miRNA-4534 and clinicopathological features of lung cancer

2.4 随访情况

随访3年，肺癌组64 例患者获得随访资料者62 例，失访率3.13%（2/64）。62 例患者中3年生存25 例、生存率40.32%（25/62），总生存时间（26.27±9.92）个月。

2.5 miRNA-4534 与肺癌预后的关系

高表达组3年生存率、生存时间均低于低表达组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3、图2。

表3 miRNA-4534 与肺癌预后的关系Table 3 Correlation between miRNA-4534 and prognosis of lung cancer

2.6 miRNA-4534 诊断肺癌预后不良的ROC 曲线

以随访3年内死亡作为预后不良绘制ROC 曲线，miRNA-4534 诊断预后不良AUC 为0.914（95%CI：0.814～0.970，P＜0.05），最佳临界值为15.69。见图3。

2.7 miRNA-4534 与肺癌患者生存期的相关性分析

Pearson 相关分析法显示：miRNA-4534 水平与肺癌患者生存期呈负相关关系（r=-0.386，P=0.002）。

3 讨论

单个miRNA 表达变化与肿瘤演进过程有紧密关联，通常miRNA 可在肿瘤患者血液中被检测出异常表达，且不易被RNA 酶降解破坏，这使得血液miRNA 成为无创检查手段热门生物标志群［5］。miRNA-4534 位于染色体22q13.1，有研究报道该miRNA 与前列腺癌侵袭性相关，通过调节血管生成抑制蛋白-1（VASH-1），促进前列腺癌的发展［6］。miRNA-4534 目前研究较少，尤其是在肺癌患者中。研究显示，VASH-1 可能参与非小细胞肺癌患者肿瘤血管的形成机制，进而促进肺癌的生长、侵袭和转移［7-8］。因此，miRNA-4534 可能也是与肺癌相关的基因，本研究探讨血清miRNA-4534在肺癌患者中的表达及其临床意义。

本研究结果显示，肺癌组miRNA-4534 相对表达量明显高于良性肺病和对照组，这与miRNA-4534 在前列腺癌、黑色素瘤等表达特点相似［6，9］。miRNA-4534 这一表达特点，提示其有可能作为肺癌患者的诊断指标。本研究数据显示，miRNA-4534 诊断肺癌发病效能良好；性别、年龄、肿瘤大小、病理类型及吸烟史与miRNA-4534 相对表达量无关；miRNA-4534 可能参与肺癌进展和侵袭转移。既往文献指出，miRNA-4534 作为致癌基因，其衰减可导致癌细胞的细胞周期停滞、凋亡，迁移侵袭能力和集落形成能力减弱［10］。严淑等［9］学者的研究显示，miRNA-4534 能通过靶基因第10 号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因（PTEN），参与人黑色素瘤的侵袭转移。而非小细胞肺癌组织中的PTEN 蛋白确实与肺癌的发生发展有关［11-12］。

PTEN 是具有磷酸酶活性的抑癌基因，可抑制磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）对下游靶蛋白的磷酸化作用，阻断蛋白激酶B（Akt）活化，抑制p-Akt 激活下游蛋白，并诱导细胞凋亡，抑制肿瘤浸润、转移，是通路中的负性调节因子，PTEN 在肺癌发生发展中具有重要作用［13-14］。miRNA-4534 直接靶向PTEN 及其下游效应子，影响PTEN 的负反馈作用，因此过表达miRNA-4534 对肺癌患者产生不良影响。当然，本研究样本量稍小，且TNM Ⅲ/Ⅳ期患者占比较多，可能会导致其结果发生偏倚。期待大样本量研究评估miRNA-4534 对肺癌的诊断价值，尤其是早期肺癌，以进一步评估miRNA-4534的临床应用价值。

本研究随访3年患者总生存率略低于胡立红等［15］学者的研究随访结果。且本研究中肺癌患者TNMⅢ/Ⅳ期占比高，这可能是患者整体预后情况不佳的原因。研究还发现，miRNA-4534 高表达组与肺癌预后相关。ROC 曲线反映出miRNA-4534在肺癌预后预测中的有效性，且生存时间与miRNA-4534 有线性相关性。值得注意的是，ROC 曲线显示miRNA-4534 诊断肺癌预后不良的最佳临界值为15.69，有一定应用价值，也待进一步研究验证。

综上所述，肺癌患者血清miRNA-4534 相对表达量显著上升，与肺癌患者TNM 分期和淋巴结转移相关，高表达miRNA-4534 者预后更差。miRNA-4534 也是诊断肺癌患者发病和预测其预后不良的有效指标。