解毒祛瘀方通过抑制巨噬细胞凋亡和增加脂代谢改善动脉粥样硬化斑块进展

姚 璠，孙三苗，冷向阳，任吉祥，王泽玉，赵为民

（长春中医药大学，长春 130117）

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种由动脉壁脂质沉积所引发的一种病理生理过程，高血脂是主要危险因素之一。Zhang 等[1]统计163 641 位成年人的血脂水平，发现全国TC、HDL-C、LDL-C 的人口加权平均值和TG 中位数分别为4.70、1.35、2.88和1.49 mmol/L；高TC、高LDL-C、低HDL-C、高TG 患病率分别为6.9%、8.1%、20.4%、13.8%；ASCVD 高危人群中，74.5% 的人LDL-C 水平失控（＜2.6 mmol/L），5.5%的人接受了治疗；对于非常高危的个体，93.2%没有达到降低LDL 的目标（＜1.8 mmol/L），其中14.5%接受了治疗。王耀等[2]通过对临床病人进行观察，发现血脂水平高的患者动脉粥样硬化发生率也高。陈孔等[3]研究发现在早期动脉粥样硬化中，巨噬细胞吞噬斑块中沉积的脂质、凋亡或坏死的细胞及细胞碎片，并将其清除，随着病程继续进展，越来越多的脂质沉积，同时巨噬细胞的吞噬及清除能力下降，形成了富含脂质的泡沫细胞，导致细胞凋亡和炎性反应。

国医大师任继学原创性提出了中医伏邪理论，在古方《验方新编》四妙勇安汤的基础上形成了解毒祛瘀方（金银花、三七粉、地龙、玄参、当归、川芎、生山楂、甘草），提出了“以解毒祛瘀方干预动脉粥样斑块形成”的治疗策略，临床效果显著。漆仲文等[4]研究证明四妙勇安汤可以减轻动脉斑块的病变程度。解毒祛瘀方在四妙勇安汤原方基础上增加了三七、地龙、川芎和生山楂，增强了其活血、化瘀、通络的功效。李晶洁等[5]临床观察表明三七粉联合他汀类药物治疗颈动脉斑块临床疗效显著，明显优于单纯使用他汀类药物，可有效减少颈部斑块，预防斑块的生成。周建国等[6]通过观察发现三七总皂苷可以抑制动脉组织脂质沉积,调节MMP-9 和TIMP-1 的表达，进而起到稳定斑块的作用。钟丽霞等[7]研究结果表明山楂粗多糖具有一定的降血糖、降血脂作用。陈萍[8]通过观察地龙多肽对高血脂大鼠的血脂变化，发现地龙多肽有较显著的降脂效果。可以发现解毒祛瘀方中的药物对于血脂及动脉粥样硬化大多都是有益的。本文旨在研究解毒祛瘀方治疗动脉粥样硬化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞获取和培养 取6 周左右的小鼠，断颈处死，剃掉腹部的毛，在75%酒精中浸泡5 s，将小鼠四肢固定，75%酒精消毒腹壁，用9 号针头5 mL 注射器沿腹中线将预冷的PBS 5 mL 注入腹腔中，可用手指轻揉腹壁，2～3 min，静置7 min。无菌条件下剪开腹壁，暴露腹膜，再次消毒后将小鼠倾向一侧，注射器吸出液体，注入50 mL 离心管内。同样做法重复2～4 次，冲洗液变澄清为止。4 ℃、400×g 离心6 min，去上清，再用PBS 同样条件下洗涤细胞3 次，去上清，加入含10%小牛血清的RPMI-1640 培养液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素10 μg/mL），用枪头吹打，使细胞悬浮。计算细胞浓度，以5×106个/mL 铺到培养皿中，放入5%CO2、37 ℃恒温、饱和湿度培养箱中培养。3 h 后洗去未贴壁的细胞，得到纯化的贴壁巨噬细胞。细胞生长面积达到70%～80%时进行传代，即用胰酶将细胞消化后重悬，加入培养液，放入培养箱中培养。

1.2 实验动物 雄性ApoE 基因敲除小鼠8 周龄，体质量19～21 g，清洁级为SPF 级，由长春中医药大学动物中心提供，动物合格证号：SCXK（吉） 2010-0008。饲以含脂肪21%（wt/wt），胆固醇1.25%（wt/wt）的高脂饲料。

1.3 实验仪器 超净台（苏州净化设备有限公司），CO2恒温培养箱（上海博迅实业有限公司），低温冰箱（青岛海尔股份有限公司），倒置显微镜 （日本奥林巴斯公司），制冰机 （河南华豫兄弟公司），电子天平（北京赛多利斯公司），纯水系统（四川沃特尔科技有限公司），恒温水浴箱（上海一恒科技有限公司），离心机（北京吴诺思科技有限公司），流式细胞仪[贝克曼库尔特生物科技（苏州）有限公司]，冻干机（上海拓纷机械设备有限公司），离心机（侧维光电TG16A-WS，上海）。

1.4 实验药品与试剂 解毒祛瘀方中药制剂 （本院中药饮片），胎牛血清（四季青公司），高脂饲料（华雅再生医学工程技术有限公司），辛伐他汀（国药集团容生制药有限公司），RPMI-1640 培养液（赛默飞世尔仪器有限公司），胰酶（Gibco 公司美国），DMSO（Sigma 公司，美国），青霉素/链霉素（160 万 u/100mL，Sigma 公司，美国），PBS（赛默飞世尔仪器有限公司），12 孔培养板（NEST 公司，中国），一次性针头过滤器 0.22 um （美国 Coring Costar 公司），无菌注射器 （山东威高集团公司），TG、TC 检测试剂盒（北京雷根生物科技有限公司），人氧化低密度脂（广州奕元生物科技有限公司）。

1.5 分组及给药 细胞实验分为5 组，1）正常组（对照组）：加入RPMI-1640 培养液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素10 μg/mL）；2）Ox-LDL 对照组（模型组）：加入含80 μg/mL Ox-LDL 的RPMI-1640 培养液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素10 μg/mL）；3）低剂量治疗组：加入含80 μg/mL Ox-LDL 和50 μg/mL JDQY 的RPMI-1640 培养液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素10 μg/mL）；4）中剂量治疗组：加入含80 μg/mL Ox-LDL 和100 μg/mL JDQY 的RPMI-1640 培养液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素10 μg/mL）；5）高剂量治疗组：加入含80 μg/mL Ox-LDL 和200 μg/mL JDQY 的RPMI-1640 培养液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素10 μg/mL）。5% CO2、37 ℃恒温、饱和湿度培养箱中培养24 h 后取出，用胰酶消化后进行检测。

动物实验将60 只ApoE-/-小鼠分为6 组，分别为对照组、模型组、低浓度治疗组、中浓度治疗组、高浓度治疗组和辛伐他汀组，每组10 只。对照组给予普通饲料，其余组给予高脂饲料喂养。8 周后，低、中、高浓度治疗组分别按解毒祛瘀方5、10、20 g/kg 体质量给药，辛伐他汀组按2.6 mg/kg 体质量给药，对照组和模型组予等量生理盐水灌胃，均按照每日1次灌胃，连续给药8 周。采集血液前，禁食12 h。解毒祛瘀方制备：原方熬制三遍后，将药液混在一起浓缩、过滤、冻干，再加蒸馏水（细胞用PBS）溶解至50 mg/mL 浓度冷冻储存

1.6 观察指标 用完全培养液调整细胞数为1.5×105个/mL，接种于24 孔板，待细胞贴壁后，分组方法同前，含药培养基加入24 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化细胞，PBS洗2次，按试剂盒说明书要求染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

采用割(剪)尾采血法，固定动物并露出鼠尾，将尾部毛剪去后消毒，然后浸在 45℃左右的温水中数分钟，使尾部血管充盈。再将尾擦干，割破尾动脉收集血液。小鼠每次可取血 0.1 mL。按照试剂盒说明书检测小鼠血清TG 和TC 水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件，采用方差分析（ANOVA）模块，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 解毒祛瘀方对ox-LDL 诱导的RAW 264.7 巨噬细胞凋亡的影响 RAW 264.7 细胞在分组培养24 h 后，进行检测。空白对照组与模型组相比凋亡细胞较少，治疗组凋亡细胞数较模型组减少（如图1）。

图1 解毒祛瘀方对ox-LDL 诱导的RAW 264.7 巨噬细胞凋亡的影响

2.2 解毒祛瘀方对高脂喂养的ApoE-/-小鼠血液中TC和TG 的影响 小鼠喂养8 周后，检测血中TG、TC水平，模型组TG、TC 较对照组均明显升高，低、中、高剂量解毒祛瘀方组可以有效降低TG、TC 水平，且有一定剂量依赖性（如图2）。

图2 解毒祛瘀方对高脂喂养的ApoE-/-小鼠血液中TC 和TG的影响

3 讨论

本研究发现，细胞实验中解毒祛瘀方可以减少动脉粥样硬化过程中由于高脂引发的巨噬细胞凋亡。巨噬细胞在加入Ox-LDL 后凋亡率与对照组相比明显增加，加入解毒祛瘀方后凋亡率有所下降，其中中剂量治疗组与模型组相比减少巨噬细胞凋亡的作用最强。在动物实验中，可以观察到模型组与对照组相比，TC、TG 水平均明显升高（P＜0.05），而各治疗组与模型组相比TC 水平均显著下降，TG 水平中高剂量治疗组下降水平最明显，辛伐他汀组TG 水平下降程度不如解毒祛瘀方各组下降明显。

Xiao Qingqing 等[9]发现7-酮基胆固醇（7-KC,ox-LDL 中主要的氧甾醇之一）引起巨噬细胞凋亡与伴随的线粒体的损伤，表现为线粒体超微结构的损伤，细胞色素C 的释放，线粒体潜在的耗散,线粒体分裂，过量的活性氧生成和Caspase-9 和Caspase-3 激活；许金鹏等[10]研究发现，巨噬细胞凋亡造成的动脉粥样硬化斑块形态学改变，会影响斑块易损性，从而造成斑块不稳定。而不稳定斑块是各种急性心脑血管疾病发生的重要条件。本研究发现解毒祛瘀方可以减少由高脂诱导的巨噬细胞凋亡，我们猜测，解毒祛瘀方可能是通过抑制动脉粥样硬化过程中巨噬细胞的凋亡来改善动脉粥样硬化斑块的进展的。

脂质浸润是动脉粥样硬化斑块形成的重要病理基础。血管内皮受到修饰低密度脂蛋白持续的慢性影响，产生损伤，内皮细胞释放趋化因子，导致单核细胞、淋巴细胞等炎性细胞在内皮损伤处黏附、聚集，由于内皮损伤通透性改变，单核细胞浸润到内膜下，分化成巨噬细胞，从而由清道夫受体（Scavenger receptors,SR）摄入氧化型低密度脂蛋白胆固醇，形成泡沫细胞，使斑块形成。2018 欧洲心脏病协会发表的共识文件[11]中明确指出血脂异常对动脉粥样硬化的影响有着密切的关系。各大指南也都把调脂药物作为临床主要推荐用药之一。本实验研究发现，解毒祛瘀方对与AS 密切相关的高脂环境有明显的改善作用。

修饰氧化低密度脂蛋白胆固醇在引起内皮损伤，炎性细胞聚集后，释放大量炎症介质，如肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor α，TNF-α）、干扰素γ（Interferon γ,INF-γ）、白细胞介素6（Interleukin 6,IL-6）等，促进炎症反应，加速细胞凋亡。从实验中发现高脂环境可以对巨噬细胞凋亡起到积极作用。因此，解毒祛瘀方改善动脉粥样硬化斑块机制可能是通过降低血脂—减少巨噬细胞凋亡实现的。