miR-1266靶向DAB2IP调控肝癌细胞的增殖和凋亡

吴晓庆，万 红，杨璞叶，钱宏波，靳稳妮，兰 琳

1.西安市第八医院肝病科，陕西 西安 710061； 2.兰州市第二人民医院感染科; 3.西安市第八医院中西医结合科; 4.西安市第八医院检验科

原发性肝细胞癌简称肝癌，是全球第五大常见恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率。我国肝炎患者的数量居世界首位，每年有大量的肝炎患者在肝硬化的基础上发展为肝癌，据统计，中国肝癌新发病例数占全球的 50%以上，对国民的健康和生命造成严重威胁[1-2]。外科手术切除是临床上治疗早期肝癌的最有效方法，但大多数肝癌患者被确诊时已是肿瘤晚期，错过了最佳手术时机。因此，研究肝癌发生、发展的分子机制，寻找潜在的肝癌治疗靶点，探寻更有效的肝癌治疗方法尤为重要。miRNA是在真核生物中发现的一类内源性且具有调控功能的非编码RNA，长度为20～25个核苷酸，可以通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度不同抑制靶基因翻译或促进靶基因降解[3]，在调控肝癌细胞增殖、凋亡、分化、侵袭等过程中发挥重要作用[4]。miR-1266是miRNA的一种，近年来研究发现，miR-1266是多种癌症发生、发展中的关键参与者和调控因子[5]，然而miR-1266在肝癌中的作用及其机制目前尚不清楚。因此，本研究旨在探讨miR-1266对肝癌细胞增殖和凋亡的影响及其调控机制，为肝癌的诊断和治疗提供新靶标和策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料选择2018年1月至2018年10月西安市第八医院肿瘤科确诊为肝癌并后期实施肝癌切除术的40例患者，患者在术前均未进行放、化疗，患者及其家属均已签署知情同意书，实验方案经我院伦理委员会批准。纳入标准：入组病例均经术前影像学及术后病理确诊为肝癌，均为原发性肿瘤接受手术切除治疗，术前均未接受任何相关放、化疗及新辅助治疗等；排除标准：排除继发性肝癌病例，合并其他部位恶性肿瘤及严重脏器功能障碍或精神、认知功能障碍等病例等。在患者进行肝癌切除手术后，对患者的肿瘤组织标本和癌周正常肝组织标本(距离患者癌组织边界>3 cm的癌旁组织)进行收集，组织离体15 min内立即置于液氮中冻存用于后续实验分析。人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院细胞库，用质量浓度为100 g/L胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，在体积分数为5%的CO2，37 ℃的恒温培养箱中进行培养，生长密集达到80%后，对细胞进行传代培养。

1.2 细胞转染将对数生长期的HepG2细胞以1×105/孔密度接种于6孔板中，置于细胞培养箱内常规培养，当细胞生长状态良好且融合度为60%左右时开始进行转染。按照LipofectamineTM2000试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书将阴性对照(NC)、miR-1266 mimics、miR-1266 mimics+pcDNA-DAB2IP分别转染入HepG2细胞中。转染完成后继续培养24 h后，更换为含10% FBS的DMEM培养基，培养24 h后，qRT-PCR检测miR-1266的表达水平，确认转染效率。

1.3 总RNA的提取及qRT-PCR使用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取组织及细胞中的总RNA，使用逆转录试剂盒(日本Takara公司)根据说明书步骤将RNA反转录成cDNA，使用SYBR Green miRNA荧光定量 PCR 试剂盒(日本Takara公司)配置20 μl PCR反应体系，在ABI 7500仪器上进行qRT-PCR反应。循环条件为95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 s；循环40次。引物由上海生工生物公司合成，引物序列如表1。以U6为内参，以2-ΔΔCt计算miR-1266和 DAB2IP mRNA的相对表达量，ΔCt = Ct目的基因-Ct内参，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

表1 miR-1266、DAB2IP、U6引物序列及扩增长度Tab 1 Primer sequences and amplification length of miR-1266, DAB2IP, U6

1.4 miR-1266靶基因预测及验证应用4个miRNA靶基因预测网站miRBase(http://www.miRbase.org/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRDB(http://www.miRdb.org/)、microRNA(http://www.microrna.org/)预测 miR-1266的靶基因，发现DAB2IP的3′-UTR与miR-1266存在结合位点。利用双荧光素酶报告基因试验进行验证，将含有DAB2IP 3′-UTR序列(WT)及其突变序列(MUT)的片段插入到双荧光素酶报告载体pmirGLO中，构建双荧光素酶报告载体质粒。利用LipofectamineTM2000 ，将miR-1266 mimics或阴性对照分别与pmirGLO-DAB2IP-WT或pmirGLO-DAB2IP-MUT重组质粒共转染至HepG2细胞中。转染完成后，在37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱中继续培养48 h，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.5 Western blotting检测收集转染48 h后的细胞，加入适量的RIPA裂解液，1200 r/min离心5 min,离心后提取细胞内总蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。每孔加入20 μg蛋白和适量SDS-PAGE上样缓冲液，在95～100 ℃水浴5 min将蛋白变性。以GAPDH作为内参，Western blotting检测各组DAB2IP蛋白的表达水平。

1.6 CCK-8增殖实验利用CCK-8法检测转染后细胞的增殖情况，HepG2以5 000个/孔的细胞密度接种于 96 孔板中，每组准备3个96孔板，在24、48、72 h 时分别取一个96孔板，每孔中加入10 μl CCK-8 试剂，在37 ℃细胞培养箱中继续培养 2 h后，使用酶标仪检测450 nm处各孔吸光度值(OD值)。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡使用Annexin V-FITC/PI染色试剂盒对细胞进行凋亡检测，收集各组转染后培养48 h的HepG2细胞，用PBS洗涤细胞2次，加入结合缓冲液制成细胞悬液；按试剂盒说明书中建议的试剂体系用量依次加入Annexin V、PI后轻轻混匀，避光室温孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结果

2.1 癌组织及癌旁组织中miR-1266、DAB2IP表达情况肝癌组织中miR-1266的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01)(见图1A)，DAB2IP的表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05)(见图1B)；对其表达水平进行Pearson相关性分析发现，肝癌组织中miR-1266与DAB2IP表达水平呈负相关(R=-0.79，P<0.01)(见图1C)。

注：A：与癌旁组织比较，**P<0.01；B：与癌旁组织比较，*P<0.05；C：miR-1266与DAB2IP表达水平的相关性分析。

2.2 miR-1266靶向下调DAB2IP表达利用miRNA数据库预测miR-1266的靶基因，通过数据库筛选发现，miR-1266可以与DAB2IP基因的3′-UTR区结合(见图2A)，是miR-1266的潜在靶基因。双荧光素酶报告基因实验检测结果显示，转染miR-1266 mimic显著抑制DAB2IP野生型质粒荧光强度(P<0.01)，而对DAB2IP突变型质粒荧光强度无影响(P>0.05，见图2B)。Western blotting检测结果显示，转染miR-1266 mimics显著降低HepG2细胞中DAB2IP蛋白的表达(见图2C)。

2.3 miR-1266通过下调DAB2IP促进HepG2细胞增殖qRT-PCR结果显示，与NC组相比，转染miR-1266 mimics可以显著提高HepG2细胞中miR-1266的表达水平(P<0.001)，miR-1266 mimics+pcDNA-DAB2IP共转染，miR-1266表达水平差异无统计学意义(P>0.05)(见图3A)。CCK-8 实验结果显示，与NC组相比，转染miR-1266 mimics显著促进了HepG2细胞的增殖活力(P<0.01)，miR-1266 mimics+pcDNA-DAB2IP共转染，细胞的增殖活力差异无统计学意义(P>0.05)(见图3B)。

注：与NC组比较，**P<0.01。

注：与NC组比较，**P<0.01,***P<0.001。

2.4 miR-1266通过下调DAB2IP抑制HepG2细胞凋亡Western blotting检测结果显示，与NC组相比，转染miR-1266 mimics可以显著降低HepG2细胞中DAB2IP蛋白的表达水平(P<0.01)，miR-1266 mimics+pcDNA-DAB2IP共转染，DAB2IP蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)(见图4A)。流式细胞仪检测结果显示，与NC组相比，转染miR-1266 mimics显著抑制了HepG2细胞的凋亡(P<0.001)，miR-1266 mimics+pcDNA-DAB2IP共转染，细胞的凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)(见图4B)。

注：与NC组比较，**P<0.01,***P<0.001。

3 讨论

肝癌是世界十大恶性肿瘤之一，发病年龄多为40～50岁，男性多见于女性，死亡率居第3位，仅次于胃癌和食管癌[6]。肝癌发病症状早期不明显，病情发展到一定程度才会产生腹部疼痛、腹部包块、食欲下降、疲乏无力、日渐消瘦等症状，给早期诊断带来巨大困难。肝癌常发生在慢性肝炎肝硬化的基础上，与肝硬化症状相似，容易被患者忽略，且恶性程度高，病情进展快，治疗难度大，治疗效果差[7]。肝癌预后差的重要原因之一是肝癌发生、发展的分子机制目前仍不明确，缺乏有效的干预靶分子[8]，因此，探索肝癌发生、发展机制，寻找有效的治疗靶点具有重要意义。

miRNA是一类长度为18～25个核苷酸的非编码RNA，成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或阻碍靶mRNA的翻译[9-10]。miR-1266是目前miRNA研究的热点之一，参与了多种癌症的调控。Sun等[11]研究发现，miR-1266通过靶向PRMT5抑制前列腺癌的生长和转移。Wang等[12]研究发现，miR-1266通过靶向DAB2IP促进宫颈癌细胞增殖、迁移和入侵。Ichihara等[13]发现，增加血清miR-1266水平参与寻常型银屑病的发展。DAB2IP是Ras-GTPase激活蛋白家族的成员之一，作为肿瘤抑制基因参与调节肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡等生物学行为[14]。此外，DAB2IP还可以调控MAPK-ERK、P13K-Akt、ASK1-JNK、GSK-3B-β-catenin等多种信号传导通路。有研究发现，DAB2IP通过激活细胞凋亡信号调节激酶(ASK1)来促进肝癌细胞凋亡[15]。Lu等[16]研究发现，miR-556-3p通过负向调控DAB2IP促进食管癌细胞的增殖。Li等[17]研究发现，miR-182通过靶向DAB2IP促进大肠癌细胞增殖、侵袭和肿瘤生长。Feng等[18]发现，miR-556-3p通过负调控DAB2IP的表达，促进膀胱癌的增殖、迁移和侵袭。目前尚未发现miR-1266与DAB2IP的关系及其在肝癌中的功能的相关研究报道，本研究从miR-1266与DAB2IP在肝癌组织中的表达及其关系、miR-1266表达对肝癌增殖和凋亡的影响两方面进行分析，以期为肝癌患者的精准治疗提供更多的理论依据。

本研究首先利用qRT-PCR检测肝癌组织中miR-1266及DAB2IP的表达水平，发现肝癌组织中miR-1266表达上调，而DAB2IP表达下调，表明miR-1266和DAB2IP可能参与肝癌的发生、发展过程。进而分析其相关性发现，miR-1266与DAB2IP表达呈负相关，基于此，我们推测在肝癌中miR-1266表达可能负向调控DAB2IP的表达。其次，通过生物信息学网站预测发现，DAB2IP可能是miR-1266的靶基因，双荧光素酶报告实验进行验证，证实DAB2IP是miR-1266的靶基因，Western blotting实验发现miR-1266可引起DAB2IP蛋白表达下调，综合以上实验结果得出miR-1266靶向作用于DAB2IP基因并引起其表达下调。最后，利用脂质体转染技术向肝癌细胞HepG2中单独转染miR-1266 mimics、共转染miR-1266 mimics和pcDNA-DAB2IP，qRT-PCR和Western blotting检测发现，转染miR-1266 mimics使miR-1266表达上调，DAB2IP表达下调，共转染miR-1266 mimics和pcDNA-DAB2IP逆转了上述现象。CCK-8实验和流式细胞仪分别检测细胞增殖和凋亡发现，转染miR-1266 mimics促进了HepG2细胞的增殖，抑制了细胞凋亡，而共转染miR-1266 mimics和pcDNA-DAB2IP逆转了上述现象。由此可见，miR-1266通过靶向下调DAB2IP表达促进肝癌细胞增殖、抑制细胞凋亡。

综上所述，肝癌组织中miR-1266表达上调，而DAB2IP表达下调；DAB2IP是miR-1266的一个靶基因；miR-1266通过靶向下调DAB2IP表达促进肝癌细胞增殖、抑制细胞凋亡。